ANEJO II

ANEJO II

Métodos de análisis de productos cárnicos 

1. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA EL ANÁLISIS 

1.1 Principio.

Las operaciones descritas a continuación tienen por finalidad conseguir una muestra para el análisis lo más homogénea posible. Por ello, toda simplificación o tratamiento insuficiente en esta operación puede conducir a unos resultados que no sean representativos.

1.2 Material y aparatos.

1.2.1 Cuchillo.

1.2.2 Trituradoras eléctricas de distinto grado de finura en el picado.

1.2.3 Frascos de vidrio de 250 ml de capacidad, de color topacio, boca ancha y tapón esmerilado.

1.2.4 Cápsulas de porcelana de 20 cm de diámetro.

1.3 Procedimiento.

1.3.1 Tomar una muestra representativa de 200 g.

1.3.2 Quitar la piel si la tuviere (embutidos, etc.).

1.3.3 Partirla con cuchillo en rodajas o trozos de 0,5-1 cm.

1.3.4 Cortar los trozos en pequeños cubos.

1.3.5 Pasarlos varias veces por trituradora hasta conseguir una mezcla homogénea.

1.3.6 La muestra, bien homogeneizada debe guardarse inmediatamente en los frascos, limpios y secos, de forma que queden llenos, para prevenir pérdidas de humedad.

1.3.7 Conservarlos en refrigeración de forma que evite su deterioro y cualquier cambio en su composición.

1.3.8 Tomar las muestras para las diferentes determinaciones a ser posible dentro de las 24 horas siguientes.

2. ALMIDÓN

(Método cualitativo)

2.1 Principio.

El almidón reacciona con el iodo dando coloración azul.

2.2 Material y aparatos.

2.2.1 Erlenmeyer de 150 ml de capacidad.

2.2.2 Frasco cuentagotas.

2.2.3 Pipeta de 10 ml de capacidad.

2.3 Reactivos.

2.3.1 Solución iodo-iodurada:

Mezclar 1 g de iodo y 2 g de ioduro potásico en agua destilada hasta 200 ml.

Mantener la solución en el frasco cuentagotas.

2.4 Procedimiento.

2.4.1 Preparación de la muestra:

Como en el método 1.

2.4.2 Valoración:

Introducir 10 g de la muestra preparada como 2.4.1 en un Erlenmeyer de 150 ml. Añadir 40 ml de agua destilada. Hervir durante 5 minutos. Transcurrido este tiempo enfriar exteriormente el matraz en corriente de agua fría.

Con pipeta de 10 ml atravesar la capa grasa superior, tomando 10 ml del líquido inferior, transvasándoles a un tubo de ensayo. Añadir 5 gotas de la solución 2.3.1.

2.5 Interpretación de resultados.

En presencia de almidón aparecerá una coloración azul-negra.

3. ALMIDÓN

(Método cuantitativo)

3.1 Principio.

Extracción de azúcares simples con etanol caliente 80 por 100, permaneciendo el almidón.‒El residuo de almidón se solubiliza con ácido perclórico diluido, y medida a 630 nm del color desarrollado al calentarlo con el reactivo antrona-sulfúrico.

3.2 Material y aparatos.

3.2.1 Balanza analítica.

3.2.2 Matraces aforados de 100 ml y 200 ml.

3.2.3 Tubos de centrífuga, cónicos, de 100 ml.

3.2.4 Pipetas graduadas de 10 ml, 25 ml, 5 ml y 2 ml.

3.2.5 Centrífuga de 2.500 r.p.m.

3.2.6 Baño de agua.

3.2.7 Baño de agua termostatable hasta 25 °C.

3.2.8 Probeta graduada de 25 ml.

3.3 Reactivos.

3.3.1 Disolución de ácido sulfúrico-antrona.‒Disolver 0,2 g de antrona en 100 ml de H₂SO₄. El reactivo sirve para 3-4 días conservándolo a 0 °C.

3.3.2 Glucosa patrón.‒Disolver 0,1 g de glucosa anhídrica en 100 ml de agua.

3.3.3 Ácido perclórico al 52 por 100.

3.3.4 Etanol al 80 por 100.

3.3.5 Etanol puro.

3.3.6 Éter de petróleo.

3.3.7 Disolución etanol-éter de petróleo (1/3) (v/v).

3.4 Procedimiento.

3.4.1 Extracción de azúcar y de grasa.‒Pesar 2 g de carne triturada preparada como en el método 1 en un tubo centrífugo cónico 100 ml. Añadir 25 ml de disolución etanol-éter de petróleo (1-3), tapar con tapón, agitar vigorosamente y centrifugar a 2.500 r.p.m. durante 5 minutos. Decantar y dejar a un lado la disolución etanol-éter de petróleo. Añadir 10 ml de etanol caliente al 80 por 100, agitar y centrifugar a 2.500 r.p.m. durante 5 minutos. Dejar a un lado la disolución alcohólica y repetir la extracción alcohólica con etanol caliente.

3.4.2 Extracción de almidón.‒Añadir 5 ml de agua al residuo y remover. Añadir 6,5 ml de disolución de ácido perclórico diluido (52 por 100); remover o agitar durante 5 minutos. Dejar reposar durante 15 minutos. Añadir 20 ml de agua y centrifugar durante 5 minutos. Verter la disolución de almidón en un frasco volumétrico de 100 ml. Añadir 6,5 ml de disolución de ácido perclórico (52 por 100) y remover. Dejar reposar durante treinta minutos. Remover y lavar el contenido entero del tubo en el frasco volumétrico que contiene el primer extracto. Llevar a volumen y filtrar por papel filtro (3.2.9).

3.4.3 Determinación de almidón.‒Diluir 5 ml de disolución de almidón filtrada en 200 ml con agua destilada. Pipetear 5 ml de dicha disolución en un tubo, enfriar en baño de María y añadir 10 ml de antrona reactivo (3.3.1) Mezclar completamente y calentar durante 7,5 minutos a 100 °C. Quitar el tubo del baño, enfriar con rapidez a 25 °C y determinar la absorbancia a 630 mm. El color permanece fijo durante treinta minutos.

3.5 Cálculos.

3.5.1 Curva patrón de glucosa.‒Diluir 1, 2, 5 y 10 ml de 3.3.2 hasta 100 ml con agua destilada. A partir de las lecturas obtenidas, dibujar la curva patrón.

3.5.2 Contenido en almidón de la muestra:

% glucosa = 0,04 • μg de glucosa leídos en la curva patrón.

% almidón = 1,06 • % glucosa.

3.6 Observaciones.

3.6.1 Teniendo en cuenta que el carragenato se determina como almidón, se deberá deducir del valor obtenido de almidón el correspondiente de carragenato.

3.6.2 En los productos que declaren contener carragenato y hasta que no exista técnica oficial para su determinación cuantitativa, se permitirá una tolerancia del 1,4 por 100 en el valor obtenido de almidón.

3.7 Bibliografía

1. W. Glover, H. Kirschenbaum y A. Caldwell (Departamento de Consumo y Comercialización, mlnisterio de Agricultura de los Estados Unidos, Laboratorios de Inspección de Carne, Nueva York, N.Y. 10011).

4. CONSERVADORES

(Por cromatografía en capa fina)

4.1 Principio.

Extracción de los conservadores por medio de una mezcla de éter y éter de petróleo y posterior identificación por cromatografía en capa fina.

4.2 Material y aparatos.

4.2.1 Homogeneizador.

4.2.2 Matraces.

4.2.3 Erlenmeyer de 25 y 250 ml.

4.2.4 Refrigerantes de reflujo.

4.2.5 Filtro Büchner y papel de filtro de filtración rápida.

4.2.6 Embudos y papel de filtro plegados.

4.2.7 Ampolla de decantación de 100 y 250 ml.

4.2.8 Cápsulas de porcelana de fondo plano.

4.2.9 Tubos pequeños de cristal con tapón.

4.2.10 Material para cromatografía en capa fina:

‒ Cubeta.

‒ Micropipetas.

‒ Secador.

‒ Fuente de ultravioleta.

‒ Placas de poliamida (20 x 20) con soporte de aluminio y revelador de fluorescencia incorporado tipo F-254 Merck, o equivalente.

4.3 Reactivos.

4.3.1 Aoluxión acuosa de ácido sulfúrico al 10 por 100 (v/v).

4.3.2. Reactivo de Carrez (para defecación).

4.3.2.1 Solución acuosa de ferrocianuro potásico al 15 por 100 (p/v).

4.3.2.2 Solución acuosa de acetato de cinc al 30 por 100 (p/v).

4.3.3 Cloruro sódico.

4.3.4 Mezcla de éter y éter de petróleo (1/1).

4.3.5 Solución acuosa saturada de cloruro sódico.

4.3.6 Sulfato de sodio anhidro.

4.3.7 Soluciones testigo conteniendo 3 g/l en la mezcla a partes iguales de éter y éter de petróleo de los siguientes conservadores:

4.3.7.1 Ácido salicílico.

4.3.7.2 Ácido benzoico.

4.3.7.3 Ácido clorobenzoico.

4.3.7.4 Ácido parahidroxibenzoico.

4.3.7.5 Éster etílico del ácido parahidroxibenzoico.

4.3.7.6 Ácido ascórbico.

4.3.8 Eluyentes:

4.3.8.1 Mezcla de n-pentano, n-hexano, ácido acético (10, 10, 3).

4.3.8.2 Mezcla de benceno, acetato de etilo, ácido acético (85, 10, 5).

4.4 Procedimiento.

4.4.1 Extracción de los conservadores.

Tomar aproximadamente 50 g de la muestra preparada como en el método 1 y transvasarla a un matraz Erlenmeyer de 250 ml.

Añadir 15 ml de solución de ácido sulfúrico al 10 por 100 diluidos en 60 ml de agua hirviendo. Añadir 10 ml de solución de ferrocianuro potásico y agitar; 10 ml de solución de acetato de cinc y agitar.

Adaptar el refrigerante de reflujo. Someter la mezcla durante treinta minutos a ebullición bajo un ligero reflujo. Filtrar rápidamente en caliente sobre un disco de papel de filtro mojado colocado sobre un embudo. El filtrado queda generalmente turbio. Añadir 2 ml de ferrocianuro potásico y agitar 2 ml de solución de acetato de cinc y agitar. Añadir 20 g, aproximadamente, de cloruro sódico. Filtrar en caliente (aproximadamente a 80 °C) sobre filtro plegado, mojado, de forma que se retengan las grasas. Enfriar el filtrado. Trasvasar el filtrado a un embudo de decantación de 250 ml. Extraer los conservadores de la fase acuosa por medio de tres lavados con 20 ml de mezcla éter y éter de petróleo agitando suavemente durante 10 minutos, aproximadamente, para evitar la formación de una emulsión. Reunir los tres extractos etéreos y eliminar la fase acuosa. Lavar dos veces la fase etérea con 20 ml de solución saturada de cloruro sódico para romper las emulsiones que eventualmente hayan podido formarse y dos veces con 20 ml de agua destilada. Transvasar la solución etérea a un matraz de 250 ml en el cual se haya puesto en el fondo un gramo de sulfato sódico anhidro. Tras dejarlo durante algunos minutos en contacto, transvasarlo a una pequeña cápsula de porcelana de fondo plano. Evaporar el disolvente a temperatura ambiente (no calentar para evitar la pérdida de ácido benzoico). Redisolver el depósito de la cápsula con algunas gotas de mezcla de éter y éter de petróleo. Lavar la cápsula dos o tres veces con el mismo disolvente para obtener un extracto de un volumen total, aproximadamente, de 0,5 ml.

4.4.2 Preparación del cromatograma.

Depositar las soluciones separadas sobre la placa de poliamida a 1 cm del borde por medio de una micropipeta (el diámetro de las manchas no debe ser mayor de 1 a 2 mm). Aplicar de la misma forma las soluciones testigo para comparar, una vez desarrollado el cromatograma, con las muestras problema, lo cual nos evita medir los Rf. Colocar la placa en la cubeta. Eluir hasta que el frente del eluyente haya recorrido los dos tercios de la placa. Sacar la placa y secar.

4.5 Interpretación de resultados.

4.5.1 El ácido salicílico ha sido escogido como sustancia de referencia, por producir fluorescencia azul de las manchas que se obtienen en los cromatogramas cuando éstos se ponen bajo luz ultravioleta, por lo cual pueden ser identificados fácil y rápidamente, bien por medida de sus Rf o bien por comparación con las manchas producidas por las soluciones testigo.

4.5.2 Rf de los conservadores.

	Ácido p-hidroxibenzoico	Éster etílico del ácido p-hidroxibenzoico	Ácido salicílico	Ácido clorobenzoico	Ácido benzoico	Ácido sórbico
Eluyente 1.	0,05	0,21	0,46	0,75	0,86	0,94
Eluyente 2.	0,10	0,56	0,25	0,54	0,70	0,82

5. NITRÓGENO TOTAL

5.1 Principio.

Ataque del producto por ácido sulfúrico concentrado, catalizado con sulfato de cobre y selenio, en el cual se transforma el nitrógeno orgánico en iones amonio, que en medio fuertemente básico, permite la destilación del amoníaco, que es recogido sobre ácido bórico. La posterior valoración con ácido clorhídrico permite el cálculo de la cantidad inicialmente presente de nitrógeno en la muestra.

5.2 Material y aparatos.

5.2.1 Balanza analítica.

5.2.2 Batería calefactora.

5.2.3 Probetas de 50 ml.

5.2.4 Matraces Kjeldahl de 800 ml.

5.2.5 Embudos de vástago largo.

5.2.6 Embudos de 8 cm. de diámetro.

5.2.7 Aparato de destilación.

5.2.8 Erlenmeyer de 200 ml.

5.2.9 Bureta con divisiones de 0,1 ml.

5.2.10 Frascos de 250 ml de boca ancha con rosca.

5.3 Reactivos.

5.3.1 Sulfato de cobre.

5.3.2 Sulfato potásico.

5.3.3 Ácido sulfúrico concentrado, d = 1,84.

5.3.4 Selenio en polvo.

5.3.5 Solución de hidróxido sódico al 40 por 100.

5.3.6 Solución de ácido bórico al 4 por 100.

5.3.7 Ácido clorhídrico 0,1 N.

5.3.8 Indicador.

Disolver 2 g de rojo de metilo y 1 g de azul de metileno en 1.000 ml de etanol al 95 por 100 (v/v). Este indicador vira de violeta a verde a pH 5,4. Conservarlo en frasco topacio.

5.3.9 Piedra pómez.

5.4 Procedimiento.

Pesar, con precisión de 0,1 mg, 1-3 g de la muestra, según contenido, preparada según el método 1. Llevar la muestra pesada al matraz Kjeldahl, e introducir sucesivamente unos granos de piedra pómez, 15 g de sulfato potásico, 0,5 g de sulfato de cobre, y una punta de espátula de selenio en polvo. Agregar 25 ml de ácido sulfúrico, mezclar suavemente por rotación y colocar el matraz en una batería calefactora, poniendo un embudo adecuado (5.2.5) en la boca. Calentar suavemente al principio, y cuando el conjunto adquiere una cierta decoloración aumentar la intensidad de calefacción. Agitar de vez en cuando con suavidad por rotación. Una vez que el líquido queda transparente, con una coloración azul verdosa, prolongar la ebullición al menos hora y media. Dejar enfriar hasta temperatura ambiente y añadir con precaución 100 ml de agua, disolviendo por rotación suave el sulfato potásico cristalizado.

En un Erlenmeyer de 200 ml poner 25 ml de ácido bórico al 4 por 100 y unas gotas de indicador (5.3.8). Introducir hasta el fondo en el Erlenmeyer la alargadera del aparato de destilación. Colocar el matraz en el aparato de destilación, ajustándolo bien, poniendo un poco de grasa en los esmerilados. Agregar, por el depósito superior, otros 100 ml de agua y 100 ml de disolución de hidróxido sódico al 40 por 100. Calentar suavemente hasta ebullición.

Aumentar el calentamiento recogiendo, al menos, 150 ml de destilado, o prolongarlo, hasta el momento en que se produzca una ebullición a golpes.

Retirar el Erlenmeyer, lavar la alargadera y el interior del refrigerante, recogiendo sobre el destilado las aguas de lavado. Valorar hasta la coloración original, violeta, con ácido clorhídrico 0,1 N. Efectuar una prueba en blanco, utilizando 5 ml de agua destilada en vez de la muestra, siguiendo todo el procedimiento.

5.5 Cálculo.

Porcentaje proteína total = 6,25 • porcentaje N total

Siendo:

f = factor del clorhídrico.

V₁ = volumen en ml de ácido clorhídrico gastado en la valoración.

V₂ = volumen en ml de ácido clorhídrico gastado en el ensayo en blanco.

p = peso en gramos de la muestra.

5.6 Referencias.

1. Norma internacional ISO R-937.

6. CENIZAS

6.1 Principio.

Adición de solución de acetato de magnesio, desecación en baño de agua o baño de arena, incineración en un horno a 550 °C y posterior determinación de la masa del residuo, teniendo en cuenta la cantidad de óxido de magnesio proveniente de la adición de la solución de acetato de magnesio utilizada en primer lugar.

6.2 Material y aparatos.

6.2.1 Cápsulas de porcelana de cuarzo o platino, con fondo plano, de aproximadamente 15 cm² de superficie y 25 mm de altura, de paredes ligeramente inclinadas.

6.2.2 Pipeta de 1 y 2 ml de doble aforo.

6.2.3 Baño de agua o baño de arena o placa calefactora.

6.2.4 Horno de mufla provisto de termostato y capaz de alcanzar al menos 800 ºC.

6.2.5 Desecador provisto de un agente deshidratante eficaz con indicador.

6.2.6 Balanza analítica.

6.2.7 Pinzas adecuadas para el manejo de las cápsulas.

6.3 Reactivos.

6.3.1 Solución de acetato magnésico, que contenga 150 g/l. Pesar 15 g del reactivo anhidro o 25 g del tetrahidrato y llevarlos, una vez disueltos, a un matraz de 100 ml; enrasar.

6.4 Procedimiento.

Introducir la cápsula bien limpia en el horno regulado a 550 °C durante 20 minutos. Sacarla e introducirla en el desecador, permaneciendo en él 30 minutos. Pesarla con una precisión de 0,1 mg.

Introducir en la cápsula un peso P de muestra, aproximadamente 5 g, preparada según el método 1 y pesada con una precisión de 0,1 mg. Añadir 1 ml de la disolución de acetato magnésico (6.3.1) uniformemente. Colocar la cápsula en un baño de arena, o placa calefactora, hasta conseguir la carbonización de la muestra, prestando mucha atención a las posibles proyecciones. Transferir la cápsula al horno de mufla que debe quedar estabilizado a 550 °C por espacio de, 31 menos, 1 hora. Si no alcanzan el grado de blancura deseado debe sacarse la cápsula, dejarla enfriar y añadir unos mililitros (2-4) de agua destilada. Evaporar el agua en baño de arena. Introducir de nuevo la cápsula en el horno de mufla por espacio de 30 minutos y repetir las operaciones anteriores si es necesario, hasta conseguir unas cenizas blancas o ligeramente grises. Sacarlas del horno e introducirlas en el desecador durante 30 minutos.

Pesar con precisión de 0,1 mg.

Efectuar dos determinaciones sobre la misma muestra.

6.5. Cálculos.

Siendo:

M_o = masa, en gramos, de la cápsula.

M₁ = masa, en gramos, de la cápsula conteniendo la muestra.

M₂ = masa, en gramos, de la cápsula y el residuo después de incineración.

M₃ = masa, en gramos, del óxido magnésico proveniente de la disolución de acetato magnésico añadido.

6.6 Observaciones.

6.6.1 La diferencia entre dos determinaciones sobre la misma muestra, realizadas simultáneamente o rápidamente una después de otra por el mismo analista, no debe ser superior a 0,10 g por 100 g de muestra.

6.7 Referencias.

1. Norma internacional ISO R-936.

7. FÓSFORO

7.1 Principio.

Transformación en ácido pirofosfórico, posterior hidrólisis del mismo y medida del color producido al añadirle el reactivo molibdato-vanadato.

7.2 Material y aparatos.

7.2.1 Matraces aforados de 1.000, 250 y 100 ml.

7.2.2 Pipetas de 10, 20 y 50 ml.

7.2.3 Matraces Kjeldahl de 500 u 800 ml.

7.2.4 Balanza analítica.

7.2.5 Espectrofotómetro capaz de efectuar lecturas a 436 nm.

7.3 Reactivos.

7.3.1 Solución de vanadato amónico.‒Disolver 2,5 g de vanadato de amonio en 500 ml de agua hirviendo. Después de refrigeración, acidular con 20 ml de ácido nítrico concentrado y diluir hasta 1.000 ml.

7.3.2 Solución de molibdato amónico.‒Disolver 100 g de molibdato amónico en 500 ml de agua a 50 °C. Después de refrigeración añadir con precaución 100 ml de ácido sulfúrico concentrado. Después de enfriar diluir hasta 1.000 ml.

7.3.3 Reactivo molibdato-vanadato.‒Una parte del reactivo 7.3.1 y una parte del reactivo 7.3.2.

7.3.4 Ácido nítrico concentrado.

7.3.5 Ácido sulfúrico concentrado.

7.3.6 Ácido sulfúrico diluido 1:10.

7.3.7 Selenio en polvo.

7.3.8 Agua oxigenada de 20 volúmenes.

7.3.9 Fosfato monopotásico.

7.4 Procedimiento.

7.4.1 Análisis de la muestra:

Introducir en un matraz Kjeldahl 5 g de la sustancia a analizar preparada según el método 1. Añadir 50 ml de H₂SO₄ concentrado y el catalizador de selenio (utilizando una punta de espátula). Dejar 12 horas en reposo. Añadir unos 20 ml de agua oxigenada. Calentar seguidamente la mezcla hasta ebullición y una vez clarificada prolongarla durante 2 horas de manera que se hidrolice todo el ácido pirofosfórico que hubiera podido formarse, Trasvasar la mezcla después de refrigeración a un vaso volumétrico de 250 ml y completar hasta el trazo de aforo con agua destilada. Si hubiera una precipitación de sulfato de calcio o de ácido salicílico, pasar la solución por un filtro cuantitativo. Para la dosificación del ácido fosfórico, hacer pasar con la pipeta 10 ml de filtrado (el equivalente de 0,2 g) de la muestra en un matraz aforado de 100 ml y añadir 20 ml de ácido sulfúrico diluido y 20 ml de reactivo de molibdato-vanadato. Completar la solución hasta el trazo de aforo con agua y efectuar la medida espectrofotométrica al cabo de 10 minutos.

7.4.2 Preparación de la curva patrón.

Disolver 4,393 g de fosfato monopotásico, previamente secado sobre ácido sulfúrico concentrado, en 1.000 ml de agua. La solución contiene un mg de P por ml. Las soluciones patrón conteniendo de 1 a 45 μg de P por ml se preparan trasvasando con la pipeta la cantidad deseada de solución P en un vaso volumétrico de 100 ml, añadiendo 20 ml de ácido sulfúrico diluido y 20 ml de reactivo de molibdato-vanadato y completando hasta el trazo de calibrado con agua destilada. Al término de 10 minutos se mide la absorción de la solución (en una cubeta de 1 cm de paso) a 436 nm contra una solución testigo, sirviéndose de un espectrofotómetro. Trazar la curva patrón.

7.5 Cálculo.

Calcular el contenido en fósforo total, expresado en porcentaje de P₂O₅ a partir de la lectura en el espectrofotómetro y con ayuda de la curva patrón.

Porcentaje P₂O₅ = 2,29 • porcentaje P

Siendo:

A = μg de fósforo leídos en la curva.

M = peso, en g de la muestra.

7.6 Bibliografía.

Pulls, G. (1961) Landwirtschaftliche Forschung, 14, 38-39.

8. CLORUROS

8.1 Principio.

Extracción de los cloruros del producto picado con agua caliente y alcohol y posterior determinación por el método Carpentier-Vohlard.

8.2 Material y aparatos.

8.2.1 Papel de filtro.

8.2.2 Embudos.

8.2.3 Matraces aforados de 250 y 200 ml.

8.2.4 Erlenmeyer de 150 y 250 ml.

8.2.5 Pipetas de 5 ml.

8.2.6 Bureta con divisiones de 0.1 ml.

8.2.7 Balanza analítica.

8.2.8 Placa calefactora.

8.2.9 Agitador magnético con calefacción.

8.2.10 Agitador de imán-teflón.

8.2.11 Vasos de precipitado de 500 ml.

8.2.12 Centrífuga provista de tubos de al menos 100 ml de capacidad.

8.3 Reactivos.

8.3.1 Solución titulada de nitrato de plata 0,1 N.

8.3.2 Solución de ácido nítrico concentrado d = 1,63.

8.3.3 Solución acuosa de sulfato férrico amónico (alumbre férrico) al 4 por 100.

8.3.4 Nitrobenceno.

8.3.5 Solución titulada de sulfocianuro potásico o amónico 0,1 N.

8.3.6 Solución de alcohol etílico al 40 por 100.

8.3.7 Reactivo de Carrez.

8.3.7.1 Solución acuosa de ferrocianuro potásico al 15 por 100.

8.3.7.2 Solución acuosa de acetato de cinc al 30 por 100.

8.4 Procedimiento.

8.4.1 Preparación del extracto.

Pesar, con precisión de 1 mg, un peso P (alrededor de 10 g) de la muestra preparada según el método 1, introduciéndola en un Erlenmeyer de 250 ml. Añadir 150 ml de alcohol al 40 por 100. Poner en el agitador y calentar suavemente. Prolongar la agitación durante una hora al menos. Transvasar a un matraz aforado de 250 ml con alcohol de 40 por 100 a través de un embudo y una varilla. Añadir consecutivamente 5 ml de cada uno de los reactivos de Carrez y enrasar. Agitar y dejar 10 minutos en reposo. Centrifugar 5 minutos a 2.000 r. p m. Separar la grasa que sobrenade con ayuda de una espátula. Filtrar en un matraz aforado de 200 ml hasta el enrase. Verter el contenido del matraz en un vaso de 500 ml, lavando con una pequeña porción de agua. Este líquido de lavado se une al inicial en el vaso. Colocar en una placa y evaporar el líquido hasta 100 ml aproximadamente para eliminar el alcohol. Dejar enfriar y llevar el líquido de nuevo al matraz de 200 ml y enrasar con agua.

8.4.2 Introducir en un Erlenmeyer de 250 ml y agitando suavemente entre adición y adición: 10 ml exactamente medidos de solución 0,1 N de nitrato de plata, 1 ml de solución de ácido nítrico concentrado, 1 ml de solución de sulfato férrico amónico al 4 por 100, 10 ml del extracto problema, 50 ml de agua destilada.

Dejar reposar durante 10 minutos en la oscuridad. Añadir 1 ml de nitrobenceno para aglomerar el precipitado y obtener una solución limpia. Valorar el exceso de nitrato de plata con la solución de sulfocianuro 0,1 N, hasta que se produzca el viraje.

8.5 Cálculos.

El tanto por ciento de cloruros presentes en la muestra, expresado en cloruro sódico, viene dado por la fórmula:

Siendo:

P = peso, en g, de la muestra de la que se ha obtenido el extracto.

n = volumen, en ml, de la solución de sulfocianuro gastados en la valoración.

9. GRASA

9.1 Principio.

Extracción de la grasa de la muestra previamente hidrolizada y desecada, por medio de hexano o éter de petróleo. Eliminación del disolvente por evaporación, desecación del residuo y posterior pesada después de enfriar.

9.2 Material y aparatos.

9.2.1 Erlenmeyer de 500 ml.

9.2.2 Vidrios de reloj.

9.2.3 Placa calefactora.

9.2.4 Papel de filtro Albet 242 ∅ o similar.

9.2.5 Embudos.

9.2.6 Extractor Soxhlet.

9.2.7 Estufa eléctrica.

9.2.8 Balanza analítica.

9.2.9 Desecador provisto de un deshidratante eficaz (gel de sílice) con indicador de humedad.

9.3 Reactivos.

9.3.1 n-hexano o éter de petróleo con un intervalo de punto de ebullición 40-60 °C e índice de bromo inferior a 1, o éter etílico anhidro exento de peróxidos.

9.3.2 Piedra pómez.

9.3.3 Ácido clorhídrico 3 N.

9.4 Procedimiento.

Pesar con aproximación de 1 mg, 2,5 g de muestra preparada como en el método 1 e introducirlos en un Erlenmeyer de 500 ml. Añadir 100 ml de ácido clorhídrico 3 N (9.3.4) y unos trozos de piedra pómez. Cubrir la boca del Erlenmeyer con un vidrio de reloj, y someter la mezcla a una ebullición suave en la placa calefactora durante 1 hora. Enfriar y filtrar sobre doble filtro evitando cualquier paso de materia grasa al filtrado. Lavar el residuo con agua fría hasta desaparición de la reacción ácida. Verificar que en el filtrado no existe materia grasa.

Colocar los papeles de filtro conteniendo el residuo sobre un vidrio de reloj y desecarlos durante hora y media en la estufa a 95-98 °C. Una vez seco el conjunto, introducirlo en el cartucho de extracción, extrayendo con el Soxhlet con éter etílico durante 6 horas, regulando la ebullición de forma que se produzcan 15 sifonadas al menos en cada hora. Eliminar el disolvente en el rotavapor y eliminar el resto del disolvente en la estufa durante hora y media a 75 °C. Enfriar el matraz con la grasa en desecador, matraz que previamente fue tarado, y pesar cuando se alcanza la temperatura ambiente.

Repetir el calentamiento y la pesada hasta que la diferencia entre dos consecutivas sea menor de 5 mg.

9.5 Cálculos.

Expresar el resultado, en porcentaje de peso:

Siendo:

P = peso, en g, del matraz.

P' = peso, en g, del matraz con la grasa.

P" = peso, en g, de la muestra.

9.6 Referencias.

1. Norma ISO-1443.

10. HUMEDAD

10.1 Principio.

Formación de una pasta con ayuda de arena y etanol, que es sometida primeramente a un presecado en baño de María y a continuación secada a 102 ± 2 °C hasta obtener un peso constante.

10.2 Material y aparatos.

10.2.1 Balanza analítica.

10.2.2 Cápsulas de acero inoxidable con tapa de 60 mm de diámetro y 25 mm de altura.

10.2.3 Varilla fina de vidrio con punta aplastada, que entre por completo en la cápsula.

10.2.4 Desecador provisto de un deshidratante eficaz (gel de sílice con indicador de humedad).

10.2.5 Baño de agua.

10.2.6 Estufa eléctrica regulada a 102 ± 2 °C.

10.3 Reactivos.

10.3.1 Arena de mar lavada a los ácidos, cuya granulometría esté comprendida entre 0,25 y 1,4 mm.

10.3.2 Etanol del 95 por 100 en volumen como mínimo.

10.4 Procedimiento.

Secar la cápsula conteniendo una cantidad de arena igual a 3-4 veces el peso de muestra y la varilla de vidrio, durante 30 minutos, en la estufa regulada a 102 ± 2 °C.

Sacarla de la estufa e introducirla en el desecador, hasta que alcance la temperatura ambiente, y pesar el conjunto con 0,1 mg de aproximación.

Introducir en dicha cápsula un peso de muestra preparada según el método 1 aproximadamente 5 g y pesar de nuevo con aproximación de 0,1 mg.

Añadir a la cápsula 5 ml de etanol (10.3.2) y remover la mezcla con la varilla de vidrio. Colocar la cápsula al baño de agua regulándolo a una temperatura comprendida entre 60 y 80 °C para evitar las posibles proyecciones, mantener el calentamiento hasta que el alcohol se evapore. Secar la muestra durante cuatro horas en la estufa a 102 ± 2 °C. Retirar la cápsula de la estufa y colocar en el desecador, hasta que alcance la temperatura ambiente. Pesar con aproximación de 0,1 mg.

Repetir las operaciones de secado hasta peso constante.

Efectuar por lo menos dos determinaciones sobre la misma muestra.

10.5 Cálculos.

Siendo:

Mo = masa, en g, de la cápsula, la varilla y la arena.

M₁ = masa, en g, de la cápsula, la varilla, la arena y la muestra antes del desecado.

M₂ = masa, en g, de la cápsula, la varilla, la arena y la muestra después del desecado.

10.6 Observaciones.

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones simultáneas o realizadas inmediatamente una después de la otra, efectuadas por el mismo analista, no debe ser superior a 0,1 g de agua por 100 g de muestra (0,1 por 100).

10.7 Referencias.

1. Norma internacional ISO R-1442.

11. AZÚCARES TOTALES, REDUCTORES Y LACTOSA

(Método de Luff-Schoorl)

11.1 Principio.

Los azúcares se disuelven en etanol diluido o bien en agua y después de la eliminación del alcohol se valoran por el método de Luff-Schoorl antes y después de la inversión.

11.2 Material y aparatos.

11.2.1 Pipetas de 1, 2, 5, 10, 25 ml.

11.2.2 Probetas de 50 ml.

11.2.3 Matraces Erlenmeyer de cuello esmerilado de 300 ml.

11.2.4 Bureta con divisiones de 0,1 ml.

11.2.5 Refrigerantes de reflujo.

11.2.6 Baño de arena.

11.2.7 Baño de agua.

11.3 Reactivos.

11.3.1 Etanol diluido al 40 por 100 (v/v) d 20 °C ≃ 0,948 llevado a punto de viraje con fenolftaleína en una parte alícuota.

11.3.2 Solución de naranja de metilo al 0,1 por 100 (p/v).

11.3.3 Ácido clorhídrico 4 N.

11.3.4 Ácido clorhídrico 0,1 N.

11.3.5 Hidróxido sódico 0,125 N.

11.3.6 Reactivo de Luff-Schoorl.

11.3.6.1 Solución A.-50 g de ácido cítrico en 500 ml de agua.

11.3.6.2 Solución B.‒Disolver 143,8 g de carbonato de sodio anhidro en 300 ml de agua caliente, dejando enfriar.

11.3.6.3 Solución C.‒Disolver 25 g de sulfato de cobre pentahidrato exento de hierro en 100 ml de agua.

Mezclar cuidadosamente la solución A con la B, añadiendo también con suave agitación la solución C, aforando el conjunto a 1.000 ml. Dejar reposar una noche y filtrar. El pH de la solución debe ser alrededor de 9,4.

Comprobar las concentraciones, que deben ser 0,1 N para el cobre y 2 N para el carbonato sódico.

11.3.7 Solución de tiosulfato sódico 0,1 N con factor exactamente calculado.

11.3.8 Solución de almidón.‒Pesar 5 g de almidón soluble, haciendo un engrudo con 30 ml de agua hirviendo; este engrudo se vierte sobre 1 l de agua hirviendo, manteniendo durante 3 minutos la ebullición, dejar enfriar, y añadir 10 mg de ioduro mercúrico como agente conservador.

11.3.9 Ácido sulfúrico 6 N.

11.3.10 Gránulos de piedra pómez.

11.3.11 Solución hidroglicérida de invertasa, conteniendo 2.750 unidades/ml.

11.3.12 Suspensión de levadura (Saccharomyces cerevisiae) 25 g de dicha levadura fresca en 100 ml de agua. Esta solución se conserva como máximo una semana en el refrigerador.

11.3.13 Soluciones de defecación.

11.3.13.1 Carrez I.‒Disolver en 50 ml de agua 24 g de acetato de cinc (CH₃COO)₂ Zn.2H₂O y 3 g de ácido acético glacial. Completar a 100 ml con agua destilada.

11.3.13.2 Carrez II.‒Disolver en 50 ml de agua 10,6 g de ferrocianuro potásico Fe(CN)₆K₄.3H₂O completando a 100 ml con agua destilada.

11.3.14 Isopentanol como antiespumante (opcional).

11.4 Procedimiento.

11.4.1 Preparación del extracto.

Como en 8.4.1.

11.4.2 Valoración de azúcares reductores.

Tomar con una pipeta una cantidad del extracto no superior a 25 ml y que contenga menos de 60 mg de azúcares reductores expresados en glucosa. Si fuera preciso tomar una cantidad menor de 25 ml (caso no frecuente en productos a base de carne) se completa hasta dichos 25 ml con agua destilada, determinándose el contenido de azúcares reductores según el método de Luff-Schoorl posteriormente descrito.

Los resultados se expresan en glucosa por ciento.

11.4.3 Valoración de azúcares totales, después de la inversión.

Se pueden seguir dos métodos:

11.4.3.1 Método químico.‒Tomar por medio de una pipeta 50 ml del extracto en un matraz de 100 ml aforado, y añadir cuatro gotas de naranja de metilo (11.3.2) y después gota a gota ácido clorhídrico 4 N (11.3.3) hasta viraje neto al color rojo. Añadir posteriormente 15 ml de clorhídrico 0,1 N (11.3.4) y llevar al baño de agua hirviente durante 30 minutos, Enfriar rápidamente a 20 °C y añadir 15 ml de NaOH 0,125 N, o la precisa para el viraje del indicador. Aforar a 100 ml con agua destilada.

Tomar una cantidad no superior a 25 ml que contenga menos de 60 mg de azúcares totales, expresados en glucosa, como en el apartado 11.4.2, determinándose el porcentaje de azúcares reductores según el método de Luff-Schoorl, que se expresa en azúcar invertido o bien en sacarosa, multiplicando el valor obtenido por el factor 0,95.

11.4.3.2 Método enzimático.‒Tomar 50 ml del extracto correspondiente en un matraz de 100 ml aforado, añadir 2 ml de solución hidroglicérida de invertasa y dejar reposar una hora a 50 °C en estufa. Enfriar a 20 °C enrasando exactamente a 100 ml.

Tomar una cantidad no superior a 25 ml y proseguir como en los casos anteriores y con las mismas especificaciones.

11.4.4 Valoración de lactosa.

Tomar en un matraz aforado de 100 ml, 50 ml del extracto correspondiente. Añadir 5 ml de suspensión de levadura (11.3.12), homogeneizar y dejar durante 2 horas en un baño a 39 °C. Enfriar a 20 ºC. Añadir 2,5 ml de solución Carrez I (11.3.13.1) agitar, añadir 2,5 ml de solución Carrez II (11.3.13.2) y agitar de nuevo. Completar el volumen a 100 ml, mezclar y filtrar. Tomar 25 ml de filtrado como máximo, y con un contenido en lactosa entre 40 y 80 mg introducirlos en un Erlenmeyer de 300 ml.

Proceder de la misma forma con un ensayo en blanco de 5 ml de levadura.

Determinar el contenido en lactosa según el método de Luff-Schoorl, los resultados se expresan en lactosa anhidra por ciento.

El método se basa en el hecho de que el Saccharomyces cerevisiae hidroliza todos los azúcares exceptuando la lactosa.

11.4.5 Valoración según el método de Luff-Schoorl.

Tomar con la pipeta 25 ml exactos del reactivo de Luff-Schoorl y verterlos en un Erlenmeyer de 300 ml sobre las correspondientes alícuotas de azúcares, añadir unos gramos de piedra pómez y calentar en tela metálica con mechero fuerte de manera que hierva dos minutos aproximadamente, llevar el Erlenmeyer a un baño de arena previamente calentado de forma que se caliente únicamente el fondo del recipiente, adaptándose un refrigerante de reflujo y manteniendo la ebullición durante 10 minutos exactos.

Enfriar rápidamente, y valorar a los 5 minutos, añadiendo 3 g de ioduro potásico disuelto en 2 ml de agua, y lentamente para evitar las proyecciones, 25 ml de ácido sulfúrico 6 N, valorando el iodo puesto en libertad con tiosulfato 0,1 N, hasta obtener un color amarillo débil, añadir el indicador de almidón (11.3.8) y terminar la valoración hasta decoloración.

Efectuar una valoración análoga en blanco, mezclando 25 ml del reactivo de Luff-Schoorl con 25 ml de agua, sin previa ebullición, y con la adición de ioduro potásico y sulfúrico 6 N.

11.5 Cálculos.

Con la ayuda de la tabla 1 determinar la cantidad de azúcar en mg correspondiente a la diferencia entre los volúmenes de tiosulfato en ml consumidos en la valoración en blanco y problema.

Sean a los mg de azúcares correspondientes:

Siendo:

P = peso, en g, de la muestra inicial de la que se obtuvo el extracto.

V = volumen, en ml, de alícuota tomada.

Esta expresión es válida cuando el extracto se haya enrasado a 250 ml.

11.6 Observaciones.

11.6.1 Los resultados obtenidos para azúcares totales realizando los dos tipos de inversión son semejantes. Pero si el análisis no se realiza con frecuencia, es preferible el método químico, por el posible deterioro de la invertasa y su alto precio.

11.6.2 La diferencia entre el porcentaje de azúcares totales y el de azúcares reductores, multiplicado por 0,95 da el contenido en sacarosa de la muestra.

11.6.3 El contenido en azúcares reductores, exceptuando la lactosa se obtiene multiplicando el valor de ésta, obtenido según (11.4.4), por 0,675 y restando este resultado del contenido en azúcares reductores totales.

TABLA 1

Para 25 ml de reactivo Luff-Schoorl

Na2S2O3 0,1 N	Glucosa, fructosa Azúcares invertidos C8H12O6		Lactosa C12H22O11		Maltosa C12H22O11
ml	mg	diferencia	mg	diferencia	mg	diferencia
1	2,4	2,4	3,3	3,7	3,9	3,9
2	4,8	2,4	7,3	3,7	7,8	3,9
3	7.2	2,5	11,0	3,7	11,7	3,9
4	9,7	2,5	14,7	3,7	15,6	4,0
5	12,2	2,5	18,4	3,7	19,6	3,9
6	14,7	2,5	22,1	3,7	23,5	4,0
7	17,2	2,5	25,8	3,7	27,5	4,0
8	19,8	2,6	29,5	3,7	31,5	4,0
9	22,4	2,6	33,2	3,8	35,5	4,0
10	25,0	2,6	37,0	3,8	39,5	4,0
11	27,6	2,7	40,8	3,8	43,5	4,0
12	30,3	2,7	44,6	3,8	47,5	4,1
13	33,0	2,7	48,4	3,8	51,6	4,1
14	35,7	2,8	52,2	3,8	55,7	4,1
15	38,5	2,8	56,0	3,9	59,8	4,1
16	41,3	2,9	59,9	3,9	63,9	4,1
17	44,2	2,9	63,8	3,9	68,0	4,2
18	47 1	2,9	67,7	4,0	72,2	4,3
19	50,0	3,0	71,7	4,0	76,5	4,4
20	53,0	3,0	75,7	4,1	80,9	4,5
21	56,0	3,1	79,8	4,1	85,4	4,6
22	59,1	3,1	83,9	4,1	90,0	4,6
23	62,2		88,0		94,6

 

12. HIDROXIPROLINA

12.1 Principio.

Previa hidrólisis en medio ácido de las proteínas y oxidación de la hidroxiprolina. El derivado formado con el p-dimetilaminobenzaldehido se valora colorimétricamente.

12.2 Material y aparatos.

12.2.1 Balanza analítica.

12.2.2 Matraces de fondo plano de 250 ml de capacidad.

12.2.3 Refrigerantes de reflujo.

12.2.4 Baño de arena.

12.2.5 Agitador magnético.

12.2.6 pH-metro.

12.2.7 Matraces aforados de 50, 100, 200 y 1.000 ml de capacidad.

12.2.8 Erlenmeyer de 250 ml de capacidad.

12.2.9 Tubos de ensayo de 16 x 160 mm, aforados a 12 ml.

12.2.10 Baño de María.

12.2.11 Espectrofotómetro o colorímetro capaces para lecturas a 560 nm.

12.2.12 Cubetas de 1 cm de paso de luz específicas para luz visible.

12.3 Reactivos.

12.3.1 Piedra pómez.

12.3.2 Solución acuosa de ácido clorhídrico al 50 por 100 (v/v) (diluir a 1.000 ml, 500 ml de solución concentrada de ácido clorhídrico de densidad 1,19).

12.3.3 Solución concentrada de hidróxido sódico de densidad 1,33 (400 g/l) (p/v).

12.3.4 Solución de hidróxido sódico al 10 por 100 (p/v).

12.3.5 Alcohol isopropilico puro.

12.3.6 Solución acuosa de cloramina T al 10,5 por 100 (p/v).

12.3.7 Solución tampón de pH = 6 (disolver 34 g de acetato sódico anhidro, 36,5 g de citrato trisódico monohidratado, 5,5 g de ácido cítrico en 385 ml de alcohol isopropílico puro y enrasar a 1.000 ml con agua destilada

12.3.8 Solución oxidante, que debe prepararse en el momento de su empleo, un Volumen de la solución 12.3.6 y cuatro volúmenes de la solución 12.3.7.

12.3.9 Solución acuosa de ácido perclórico al 17,5 por 100.

12.3.10 Solución de p-dimetilaminobenzaldehido (p-DMAB) al 5 por 100 en alcohol isopropilico. Esta solución se conserva una semana a temperatura ambiente.

12.3.11 L-hidroxiprolina.

12.4 Procedimiento.

12.4.1 Preparación de la muestra.

Pesar con 1 mg de aproximación P gramos de la muestra convenientemente homogeneizada (aproximadamente 3 g) sobre papel de fumar sin engomar, e introducir la muestra en el matraz de fondo plano (12.2.2). Añadir piedra pómez 50 ml de la solución de ácido clorhídrico al 50 por 100 (12.3.2). Montar los refrigerantes de reflujo y colocarlos en el baño de arena. Calentar de forma que se mantenga una ebullición suave al menos durante siete horas. Refrigerar rápidamente los matraces bajo corriente de agua. Ajustar el contenido de los matraces a un pH comprendido entre 6 y 7, añadiendo y agitando fuertemente 28 ml de la solución concentrada de hidróxido sódico, dejar enfriar al chorro de agua y llevar al pH anteriormente indicado con solución diluida de hidróxido sódico (12.3.4). Transferir el contenido a un matraz aforado de 200 ml y enrasar dejando en reposo durante una hora. Filtrar a través de papel de filtro plegado. Tomar una alícuota del filtrado y diluirla 10 o 20 veces con agua destilada. Es conveniente realizar ambas diluciones, porque permiten obtener dos valores sobre la misma muestra.

12.4.2 Preparación de la curva patrón.

La coloración obtenida sigue la ley de Beer-Lambert cuando la concentración de hidroxiprolina se encuentra comprendida entre 0 y 20 μg/ml.

Teniendo en cuenta los numerosos factores que influyen en la formación del derivado coloreado, es indispensable construir para cada determinación una curva patrón, realizándose el desarrollo del color al mismo tiempo sobre las diluciones problema y los patrones.

Preparar una solución madre conteniendo 400 μg/ml de hidroxiprolina con agua destilada. A partir de esta solución, hacer diluciones que contengan 5, 10 y 20 μg/ml con agua destilada. Tomar una serie de tubos de ensayo aforados a 12 ml y poner en uno de ellos (tubo testigo) 1 ml de agua destilada. En los tres siguientes colocar 1 ml de las soluciones que contienen 5, 10 y 20 μg/ml de hidroxiprolina. En los dos siguientes 1 ml de cada una de las diluciones diluidas del filtrado. Añadir a cada tubo sucesivamente: 2 ml de isopropanol puro (12.3.5) y 1 ml de la solución oxidante recientemente preparada (12.3.8) y agitar. Dejar reposar durante 10 minutos, transcurrido dicho tiempo añadir de nuevo a cada tubo: 3 ml de la solución de ácido perclórico al 17,5 por 100 (12.3.9) y 2 ml de p-DMAB (12.3.10), homogeneizar el contenido de los tubos y llevarlos al baño de María regulado a 60 °C, permaneciendo en él 20 minutos, retirarlos del baño y enfriarlos balo corriente de agua. Ajustar hasta 12 ml con isopropanol y agitar.

Leer la densidad óptica de cada tubo ajustando el cero con el tubo testigo a 560 nm.

Trazar la correspondiente curva patrón, colocando en abcisas las absorbancias y ordenadas las concentraciones en μg/m1 de hidroxiprolina.

12.5 Cálculos.

Siendo:

x = cantidad de hidroxiprolina leída en la curva patrón.

d = dilución del filtrado realizado.

P = peso inicial de la muestra.

Porcentaje colágeno = 8 % de hidroxiprolina.

12.6 Observaciones.

12.6.1 Cuando la muestra a analizar sea de alto contenido en colágeno, el tiempo de ebullición deberá prolongarse al menos durante nueve horas.

13. NITRITOS

13.1 Principio.

Del extracto obtenido, adicionándole ácido sulfanílico y α-nactilamina, se lee la intensidad de la coloración obtenida mediante colorimetría o espectrofotometría.

13.2 Material y aparatos.

13.2.1 Matraces aforados de 100 y 1.000 ml de capacidad.

13.2.2 Probetas de 100 ó 200 ml de capacidad.

13.2.3 Baño de María.

13.2.4 Papel de filtro plegado de 15 cm de diámetro aproximadamente.

13.2.5 Tubos de ensayo de 150 x 25 mm.

13.2.6 Matraces Erlenmeyer de 300 ml de capacidad.

13.2.7 Espectrofotómetro capaz de leer a 520 nm.

13.2.8 Cubetas de 1 cm de paso específicas para luz visible.

13.3 Reactivos.

13.3.1 Solución patrón de nitrito sódico.‒Pesar, con aproximación de 1 mg, 1 g de nitrito sódico, disolver en agua y completar hasta 1.000 ml. Tomar con la pipeta 5 ml de esta solución e introducirla en otro matraz aforado de 1.000 ml. Enrasar.

13.3.2 Reactivo colorimétrico.

13.3.2.1 Solución L‒Disolver calentando al baño de María 6 g de ácido sulfanílico en 200 ml de ácido acético glacial y 400 ml de agua destilada. Añadir 200 ml de una solución de cloruro sódico que contiene 100 g/l de cloruro sódico. Diluir con agua hasta 1.000 ml.

13.3.2.2 Solución II.‒Disolver calentando al baño de María 0,3 g de cloruro de oc-naftilamina en 100 ml de agua destilada. Filtrar si es necesario y añadir 200 ml de acético glacial. Diluir hasta 1.000 ml con agua destilada.

Manipular con precaución esta disolución por su carácter cancerígeno.

Ambas soluciones (13.3.2.1 y 13.3.2.2) deben conservarse en frascos topacio bien cerrados. El reactivo colorimétrico se obtiene mezclando volúmenes iguales de ambas soluciones.

13.4 Procedimiento.

13.4.1 Preparación del extracto.‒Como en 8.4.1.

13.4.2 Valoración de la muestra.‒Del extracto obtenido en 13.4.1, tomar 25 ml y añadir 1 g, aproximadamente, de carbón activo si es necesario decolorar. Filtrar hasta que el filtrado sea transparente. Del filtrado tomar una alícuota de 10 ml y ponerla en un tubo de ensayo 13.2.5. Si se toman menos de 10 ml, completar hasta 10 ml con agua destilada. Añadir 10 ml del reactivo colorimétrico, mezclar y dejar reposar la solución quince minutos a temperatura ambiente al abrigo de la luz.

A partir de los 20 minutos y antes de 4 horas, medir la densidad óptica de la solución en una cubeta de 1 cm de paso de luz a 520 nm de longitud de onda.

Si la solución coloreada problema presenta una coloración superior a la de la solución patrón más concentrada, tomar una alícuota menor de 10 ml.

Efectuar dos determinaciones sobre la misma muestra.

13.4.3 Preparación de la curva patrón.‒Tomar de la solución patrón (13.3.1) alícuotas de 5, 10 y 20 ml y llevar a 100 ml con agua. El contenido de estas soluciones es, respectivamente, de 0,25, 0,50 y 1 p. p. m. de nitrito sódico.

Transferir 10 ml de cada una de estas soluciones a un tubo de ensayo (13.2.5), añadir 10 ml del reactivo colorimétrico y proceder a su valoración colorimétrica o espectrofotométrica a 520 nm, llevando absorbancias frente a concentraciones expresadas en p. p. m. da nitrito sódico.

13.5 Cálculos.

Calcular el contenido en nitritos de la muestra expresado en p. p. m. por medio de la fórmula:

m = peso de muestra de la que se ha obtenido el extracto.

V = volumen, en ml tomado del extracto decolorado.

C = concentración en nitrito sódico expresada en μg/ml determinada sobre la curva patrón.

Tomar como resultado la media de los valores obtenidos en dos determinaciones paralelas si las condiciones de reproducibilidad se cumplen.

13.6 Observaciones.

La diferencia entre dos determinaciones paralelas sobre una misma muestra, realizadas simultáneamente por el mismo analista, no debe ser superior al 10 por 100 del contenido calculado en nitritos.

13.7 Referencias.

1. Norma ISO/DIS 2918.

14. NITRATOS

14.1 Principio.

Al reaccionar en medio sulfúrico los nitratos con la brucina se produce una coloración amarilla-marrón, cuya intensidad es proporcional al contenido en nitratos presentes, lo que permite su valoración colorimétrica o espectrofotométrica.

14.2 Material y aparatos.

14.2.1 Matraz aforado de 50 ml de capacidad.

14.2.2 Espectrofotómetro o colorímetro capaces para lecturas a 410 nm.

14.2.3 Cubetas de 1 cm de paso específicas para luz visible.

14.3 Reactivos.

14.3.1 Solución patrón de nitratos.‒Disolver 0,1629 g de nitrato potásico anhidro en agua y enrasar a 1 l. 1 ml de esta solución contiene 0,1 mg de nitrato.

14.3.2 Reactivo brucina-Ácido sulfanílico.‒Disolver 1 g de brucina y 0,1 g de ácido sulfanílico en unos 70 ml de agua destilada caliente, añadir 3 ml de ácido clorhídrico concentrado, dejar enfriar y enrasar a 100 ml con agua. La solución debe guardarse en frasco color topacio.

14.3.3 Solución de ácido sulfúrico.‒Añadir con cuidado 500 ml de ácido sulfúrico concentrado a 75 ml de agua destilada. Debe conservarse herméticamente cerrado.

14.4 Procedimiento.

14.4.1 Preparación del extracto.‒Como en 8.4.1.

14.4.2 Valoración de la muestra.‒Introducir en un matraz aforado de 50 ml de capacidad 10 ml del extracto (14.4.1), 1 ml del reactivo (14.3.2) y 10 ml del reactivo (14.3.3) muy lentamente, mezclar y dejar en reposo durante diez minutos al abrigo de la luz.

Pasado este tiempo, añadir agua destilada, agitando, hasta completar unos 40 ml y dejar reposar durante quince minutos en la oscuridad.

Enfriar el matraz en un baño de hielo hasta que alcance la temperatura ambiente, preferiblemente también en la oscuridad. A continuación, enrasar a 50 ml con agua, homogeneizar el contenido del matraz y leer la absorbancia a 410 nm. El cero se ajusta con 20 ml de agua sometida al proceso anteriormente descrito.

14.4.3 Preparación de la curva patrón. Tomar distintas alícuotas de la solución 14.3.1 y tratar como en 14.4.2.

14.5 Cálculos.

Llevar la absorbancia obtenida a la curva patrón y expresar el correspondiente contenido de nitratos en mg por kg.

14.6 Observaciones.

14.6.1 Periódicamente resulta aconsejable confirmar o rectificar los valores de la curva patrón, lo que es absolutamente necesario cuando se cambia de reactivos.

14.6.2 En las condiciones citadas, se pueden medir concentraciones de nitrato comprendidas entre 50 y 500 μ g/l.

14.6.3 El ácido sulfanílico se añade al reactivo 14.3.2 para evitar la posible interferencia del ion nitrito. Las interferencias de iones ferrosos, férricos y manganosos sólo son apreciables cuando su concentración es superior a 1 mg/l.

15. pH

15.1 Principio.

Medida del potencial eléctrico creado en la membrana de un electrodo de vidrio, función de la actividad de iones hidrógeno a ambos lados de la membrana. Utilizar como referencia un electrodo de calomelanos.

15.2 Material y aparatos.

15.2.1 pH-metro capaz de determinar la segunda cifra decimal.

15.2.2 Electrodos de vidrio de punta fina o convencional (según la dureza de la muestra).

15.2.3 Electrodo de calomelanos.

15.3 Reactivos.

15.3.1 Disolución tampón de pH = 4.

15.3.2 Disolución tampón de pH = 7

15.4 Procedimiento.

Tomar una cantidad de muestra preparada según el método 1 o bien directamente, en el caso de muestras homogéneas, añadir igual cantidad de agua destilada, mezclar y dejar reposar durante diez minutos.

Ajustar el pH-metro a la temperatura de trabajo con las disoluciones 15.3.1 y 15.3.2 e introducir los electrodos de vidrio y de referencia, separados a. menos 2 cm.

Conectar el pH-metro y esperar a que se estabilice.

15.5 Expresión de los resultados.

Anotar el valor de pH indicado por el aparato.

Repetir la operación dos veces al menos.

15.6 Observaciones.

15.6.1 Es necesaria una limpieza escrupulosa de los electrodos entre determinaciones sucesivas, lo que al tratarse de productos con un alto contenido en materia grasa es más laboriosa que en disoluciones desengrasadas, requiriendo a veces ser frotados o sumergidos en alcohol, éter dietílico, éter de petróleo, etcétera; secarlos convenientemente y lavarlos finalmente con agua destilada; secarlos de nuevo, quedando así dispuestos para una nueva lectura.

MÉTODOS BIOLÓGICOS

1. IDENTIFICACIÓN DE ESPECIE ANIMAL

1.1 Principio.

Las proteínas musculares de las distintas especies animales, aunque muy similares entre sí, tienen en cada grupo zoológico una estructura específica que permite diferenciar carnes de especies distintas por métodos serológicos (técnica de Uhlenhuth).

Sólo es aplicable a productos crudos.

1.2 Material y aparatos.

1.2.1 Tubos de precipitación de 20 x 4 mm.

1.2.2 Gradillas metálicas para los tubos anteriores.

1.2.3 Precipitoscopio (cámara oscura con luz indirecta).

1.2.4 Pipetas capilares muy finas.

1.2.5 Pinzas.

1.2.6 Bisturí.

1.2.7 Tijeras.

1.2.8 Gasa.

1.2.9 Papel de filtro.

1.2.10 Tubos de ensayo.

1.2.11 Erlenmeyer de 250 ml de capacidad.

1.3 Reactivos.

1.3.1 Suero fisiológico estéril.

1.3.2 Antisueros específicos (su especificidad debe ser contrastada en el momento de su utilización).

1.4 Procedimiento.

Separar del producto cárnico entre 5 y 10 g de carne magra lo más exenta posible de grasa. Picar en trozos muy pequeños, poniéndose a macerar en suero fisiológico estéril en la proporción de 1/10 Mantener el macerado puesto en un Erlenmeyer de 250 ml en frigorífico durante 24 horas, al objeto de evitar la proliferación bacteriana.

Transcurridas las 24 horas, filtrar el macerado a través de gasa y papel de filtro cuantas veces sea necesario, hasta obtener un líquido transparente, sin importar que tenga coloración propia. Diluir el filtrado, que estaba a 1/10, hasta 1/25 y 1/50.

Poner en una gradilla metálica tres tubos de precipitación para las tres diluciones preparadas. Tomar con pipeta capilar una para cada dilución, partes de las disoluciones (antígeno problema), llevándolo hasta el fondo de los tubos. Colocar seguidamente el antisuero que se ensaya (anticuerpo específico conocido) en los tres tubos mediante pipeta capilar muy fina de la manera siguiente: Poner el tubo conteniendo el antígeno problema en posición horizontal, llevando en este momento la pipeta con el antisuero hasta el fondo del tubo, momento en que se vuelve a poner el tubo en posición vertical, con le que saldrá una pequeña cantidad de antisuero que desplazará hacia arriba el antígeno, pero sin mezclarse con él; volver a poner de nuevo en posición horizontal el tubo, sacando rápidamente la pipeta que contiene el antisuero. El tubo debe estar siempre en posición horizontal a la entrada o la salida de la pipeta con el antisuero, evitando de esta forma que los dos líquidos reaccionantes se mezclen. Utilizar una sola pipeta para cada antisuero. Es conveniente poner dos tubos testigos, uno para el suero y otro para el antígeno, testigos que necesariamente deben dar siempre reacción negativa.

1.5 Interpretación de resultados.

La reacción positiva se produce con la aparición de un anillo blanquecino, opalescente, en la zona de separación de ambos líquidos reaccionantes antes de 15 minutos. Reacciones positivas posteriores a este tiempo deben considerarse inespecíficas. La reacción tiene lugar, para un mismo antígeno, a distintos tiempos, según sea el título del antisuero empleado.

1.6 Observaciones.

1.6.1 La lectura de los resultados debe hacerse con luz intensa indirecta y sobre fondo oscuro, preferiblemente en un precipitoscopio.

1.7 Referencias.

1. Normalización de Técnicas en Bromatología Sanitaria. F. Pérez Flórez. 1970.