ANEJO III

ANEJO III

Métodos de análisis de cereales y derivados

16. ÁCIDO ASCÓRBICO (VITAMINA C)

(Método cualitativo)

16.1 Principio.

Este método sirve para determinar la presencia de vitamina C en harina y consiste en la aparición de puntos blancos sobre fondo rosa del reactivo sal sódica del 2,6 diclorofenol indofenol en medio ácido.

16.2 Material y aparatos.

16.2.1 Placa Petri de 65 cm².

16.3 Reactivos.

16.3.1 Disolución acuosa al 0,05 por 100 de la sal sódica del 2,6 diclorofenol indofenol.

16.3.2 Disolución acuosa al 5 por 100 de ácido metafosfórico.

16.4 Procedimiento.

Extender 10 g de la muestra sobre una placa de vidrio compactándola de forma que quede bien uniforme. Rociar por completo con la disolución del ácido metafosfórico y a continuación hacer lo mismo con la disolución de la sal sódica del 2,6 diclorofenol indofenol. Al cabo de unos minutos aparecen unos puntos blancos más o menos grandes sobre el fondo rosa.

18. FÓSFORO

18.1 Principio.

Transformación de los compuestos fosforados en ortofosfatos y posterior valoración colorimétrica con fosfomolibdovanadato.

18.2 Material y aparatos.

18.2.1 Espectrofotómetro o colorímetro que permita lecturas a 430 nm.

18.2.2 Crisoles de porcelana, de 35 mm de diámetro y 45 milímetros de altura, sin tapadera.

18.2.3 Matraces aforados de 100 y 500 ml de capacidad.

18.2.4 Baño de agua.

18.2.5 Estufa de desecación con sensibilidad de ± 1 ºC.

18.3 Reactivos.

18.3.1 Amoníaco concentrado de densidad ρ = 0,910 g/ml.

18.3.2 Disolución de molibdato amónico al 10 por 100 (p/v). Disolver 100 g de molibdato amónico en agua caliente; añadir 10 ml de amoníaco concentrado de ρ = 0,910 g/cm³ para asegurar su conservación y completar hasta 1.000 ml con agua destilada.

18.3.3 Ácido nítrico de densidad ρ = 1,38 g/ml.

18.3.4 Ácido nítrico al 10 por 100 (p/v).‒Disolver 16 ml de ácido nítrico ρ = 1,38 g/cm³, hasta 100 ml con agua destilada.

18.3.5 Disolución de metavanadato de amonio.‒Disolver 2,35 gramos de metavanadato de amonio en 400 ml de agua destilada y caliente. Añadir lentamente y agitando 20 ml de la disolución que contiene 7 ml de ácido nítrico ρ = 1,381 g/ml y 13 ml de agua destilada.

18.3.6 Reactivo nitromolibdovanadato.‒Mezclar 200 ml de la disolución de molibdato amónico al 10 por 100 y 200 ml de la disolución de metavanadato de amonio, con 134 ml de ácido nítrico ρ = 1,381 g/cm3 o en su lugar 192 ml de ácido nítrico ρ = 1,331 g/ml.

18.3.7 Ácido clorhídrico concentrado de densidad ρ = 1,19 g/ml.

18.3.8 Disolución patrón de fósforo.‒Pesar 4,394 g de fosfato monopotásico, previamente desecado en estufa a 100 °C durante unas doce horas. Disolver en agua destilada y llevar a un volumen de 1.000 ml en un matraz aforado, 1 ml corresponde a 1.000 gammas de fósforo

18.3.9 Disoluciones patrones.‒Tomar 10 ml de la disolución anterior y diluir con agua destilada hasta el enrase en un matraz aforado de 100 ml, obteniéndose una concentración de 100 gammas de fósforo por mililitro. Tomar partes alícuotas de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 y 2,5 ml y llevar a un volumen de 10 ml con agua destilada. Su concentración será de 5, 10, 15, 20 y 25 gammas /ml. Añadir 10 ml del reactivo nitromolibdovanadato y proceder como se describe en el método.

18.4 Procedimiento.

Pesar, con una aproximación de ± 0,1 mg, de 0,3 a 1,5 g de muestra en un crisol previamente calcinado y tarado. Introducir el crisol en la mufla a una temperatura inferior a 100 °C. Aumentar la temperatura paulatinamente hasta alcanzar los 550 °C; mantener esta temperatura durante 2 horas. No se debe pasar de 550 °C, para evitar decrepitaciones y volatilizaciones, ya que cuando existen cloruros en el producto a analizar, puedan afectar a los resultados. El tiempo que debe permanecer el crisol con la muestra en la mufla es variable y estará de acuerdo con la naturaleza y con la cantidad de la muestra. Suelen ser suficientes 2 horas, pero si transcurrido este tiempo las cenizas del crisol no presentan el color blanco grisáceo deseado, sacar el crisol de la muña y dejar enfriar dentro de un desecador, añadiendo posteriormente unas gotas de agua o, mejor, unas gotas de agua oxigenada de 50 volúmenes, introducir el crisol en la estufa de desecación a 100 °C para eliminar el agua o el agua oxigenada. Eliminada la humedad, introducir nuevamente el crisol en la mufla a 550 °C. Dejar transcurrir el tiempo necesario hasta que las cenizas contenidas en el crisol alcancen el color deseado. Sacar el crisol de la mufla y llevar a un desecador con sustancias desecadoras. Dejar enfriar hasta la temperatura ambiente.

Obtenidas las cenizas, añadir en el crisol una cantidad de ácido clorhídrico concentrado (18.3.7) hasta que las cenizas queden cubiertas Evaporar el ácido clorhídrico en el baño de agua a ebullición, hasta sequedad, en un dispositivo adecuado para la eliminación de vapores ácidos. Disolver el residuo en 3 ml de ácido nítrico al 10 por 100 y hervir en el baño de agua durante 5 minutos, utilizando el dispositivo adecuado para la eliminación de los vapores ácidos. No se debe dejar secar el contenido para evitar la hidrólisis de los ortofosfatos que produciría reacciones coloreadas Filtrar a través de papel, sobre un matraz aforado de 500 ml, lavando con agua destilada los crisoles donde estaban contenidas las cenizas y diluir hasta el enrase.

Para desarrollar la reacción de color, colocar, en una cubeta o tubo de espectrofotómetro o fotocolorímetro, 10 ml de la disolución problema y añadir 10 ml del reactivo nitromolibdovanadato. Agitar, dejar reposar durante diez minutos. Efectuar la lectura espectrofotométrica o fotocolorimétrica a 430 nm, utilizando como blanco la mezcla de 10 ml de agua destilada y 10 ml de reactivo nitromolibdovanadato. La coloración amarilla desarrollada es estable durante varios días.

18.5 Cálculos.

Leer en el espectrofotómetro o fotocolorímetro y buscar su correspondencia en fósforo en la curva patrón.

Siendo:

F = concentración de fósforo, en gammas, encontrada en la curva patrón/10 ml disolución.

P = peso, en gramos, de la muestra empleada.

18.6 Referencias.

1. Instituto de Racionalización y Normalización del Trabajo. Una Norma Española UNE 64017.

19. DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE HARINAS DE TRIGOCOMÚN (TRITICUM VULGARE) EN SÉMOLAS Y PASTAS ALIMENTICIAS

19.1 Principio.

 

El método se basa en la detección y cuantificación de un componente designado CM₂, del extracto cloroformo-metanol del endospermo de trigo o de productos derivados de él, cuyo control genético radica en el cromosoma 1D de «Triticum Vulgare» y que por tanto no se encuentra en «T. durum».

El mencionado extracto, al que se designa proteína CM, se fracciona por electroforesis sobre gel de almidón, y el componente CM₁ se estima visualmente o se cuantifica densitométricamente.

19.2 Material y aparatos.

19.2.1 Balanza analítica.

19.2.2 Equipo de electroforesis.‒Fuente de tensión, corriente continua 0-500 V, ‒100 mA. Placas de vidrio de 20 x 20 cm marcos de plástico de 20 x 20 cm exterior, de 18 x 18 cm interior y de 3 mm de espesor. Depósitos de electrodos de 20 x 10 x 10 centímetros.

19.2.3 Densitómetro de reflexión en el caso de que se quiera cuantificar.

19.2.4 Tubos de 8 x 50 mm o similar, con tapones de corcho.

19.2.5 Gradilla.

19.2.6 Dos placas de acero inoxidable de 5 x 7 x 1 cm o dimensiones similares.

19.2.7 Jeringa de vidrio de 1 ml de capacidad.

19.2.8 Capilares de 10 cm de largo.

19.2.9 Placa de porcelana con pocillos.

19.2.10 Probetas de 100 ml y 1.000 ml.

19.2.11 Vasos de 500 ml y de 1.000 ml.

19.2.12 Baño de agua con termómetro.

19.2.13 Cubeta de plástico de al menos 25 x 25 x 5 cm.

19.3 Reactivos.

19.3.1 Cloroformo.

19.3.2 Metanol.

19.3.3 Éter dietílico libre de peróxidos.

19.3.4 Etanol del 70 por 100.

19.3.5 Papel Albet número 502, o similar, y papel de filtro.

19.3.6 Almidón hidrolizado para electroforesis Connauglit o similar.

19.3.7 Tampón lactato de aluminio-ácido láctico, 0,1 N, pH 3,2 en urea 3 M.‒Diluir 4,9 g de lactato de aluminio en agua destilada, añadir 10,6 ml de ácido láctico purísimo y 180 g de urea, completando hasta 1 litro con agua destilada. Este tampón sirve tanto para el gel de almidón como para los compartimentos de los electrodos.

19.3.8 Solución de nigrosina soluble en agua al 0,5 por 100 en acético-agua (1/1) (v/v).

19.3.9 Gel de almidón.‒Mezclar 24,5 g de almidón y 180 ml de tampón en un vaso de 500 ml, agitar suavemente con una varilla en baño de agua a 80 ± 3 ºC hasta que gelifique (2-3 minutos). El gel caliente se vierte sobre una placa de vidrio a la que se ha superpuesto un marco de plástico de las mismas dimensiones externas que la placa y de 3 mm de espesor, extender uniformemente con la varilla y, finalmente, prensar suavemente con una placa de vidrio de las mismas dimensiones sin dejar burbujas. Dejar reposar durante al menos 3 horas.

19.4 Procedimiento.

19.4.1 Extracción y preparación para electroforesis de la proteína CM.‒Pesar 50 mg de harina, sémola, grano o pasta alimenticia y transferirlos o un tubo de 8 x 50 mm o similar. El grano y la pasta se aplastan por presión entre dos placas de acero inoxidable antes de ser transferidas al tubo. Añadir aproximadamente 0,5 ml de éter dietílico en cada tubo y dejar reposar durante no menos de 30 minutos, agitando ocasionalmente. Después de la última agitación se deja sedimentar por gravedad y el sobrenadante se elimina con la ayuda de una jeringa. El disolvente residual se deja evaporar a la temperatura ambiente o en una estufa a 35 °C durante 10 minutos. Agregar aproximadamente 0,25 ml de cloroformo-metanol (2/1) (v/v) a cada tubo, tapar y dejar reposar durante 2 horas, agitando ocasionalmente.

Después de la última agitación, dejar sedimentar por gravedad y transferir el extracto sobrenadante con un capilar a una pieza de papel Albet número 502 o similar, de dimensiones 3 x 10 mm. Con el capilar se satura el papel, que se deja evaporar antes de una nueva adición (ver 19.6.4), repitiendo la operación hasta agotar el sobrenadante. Para esta operación, las piezas de papel a las que se van a transferir las distintas muestras se depositan en distintos pocillos de una placa de porcelana o similar Se recomienda realizar la transferencia entre 10 y 20 muestras simultáneamente.

19.4.2 Electroforesis sobre gel de almidón de la proteína CM.‒Separar cuidadosamente una de las placas de vidrio con la ayuda de una espátula y recubrir la superficie expuesta del gel con un plástico fino. Marcar en dicha superficie una fila de ranuras (1 cm de largo cada una) a 3 cm de uno de los bordes del gel. Alojar en dicha ranura las piezas de papel Albet número 502 o similar que portan las muestras, previamente impregnadas con tampón. Disponer el gel horizontalmente apoyado sobre las cubetas de electrodos y establecer la conexión eléctrica mediante puentes de papel de filtro (20 papeles de dimensiones apropiadas superpuestos).

19.5 Interpretación de resultados.

19.5.1 Detección de trigo exaploide.‒La electroforesis del extracto CM de trigo exaploide («T. Vulgare») muestra tres bandas designadas CM₁, CM₂ y CM₃, mientras que la de trigo tetraploide («T. durum») sólo presenta dos CM₂ y CM₃.

El trigo exaploide se detecta en una mezcla por la aparición de CM₁ en el perfil electroforético. Para el tamaño de muestra anteriormente propuesto, CM₁ se detecta en mezcla de 10-15 por 100. Usando muestras de tamaño doble, el umbral de detección se reduce proporcionalmente.

19.5.2 Cuantificación de trigo exaploide en mezclas.‒La acotación del porcentaje de «T. Vulgare» en una mezcla se basa en la cuantificación de la relación CM₁, CM₂ y en la estimación de la variabilidad intraespecífica de CM₁ y CM₂.

En la figura 1-A se presenta la forma de acotar gráficamente el porcentaje de trigo exaploide en mezclas basándose en la medida de la relación CM₁, CM₂ mediante densitometría de reflectancia con luz de 620 mm. En la figura 1-B se representa la variación de la amplitud de la acotación según el valor obtenido.

Una estimación semicuantitativa, más imprecisa que la anterior, puede obtenerse por comparación visual del problema con una serie de mezclas conocidas que pueden incorporarse al mismo gel.

19.6 Observaciones.

19.6.1 Las condiciones de electroforesis son 10 V/cm durante seis horas.

19.6.2 La tinción se realiza con nigrosina al 0,05 por 100 en acético.‒Agua (1/1) (v/v) durante 14-16 horas en una cubeta de plástico de dimensiones apropiadas, dejando el gel con la cara opuesta a la de inserción hacia arriba.

19.6.3 La decoloración del fondo se realiza en pocos minutos con etanol al 70 por ICO.

19.6.4 Cuando se manejan 10-20 muestras, después de una transferencia se devuelve el capilar al tubo y se pasa a la muestra siguiente. Cuando se llega a la muestra final, ya se ha evaporado la primera y está en condiciones de una nueva transferencia.

19.7 Referencias.

1. R. García Faure y F. García Olmedo: «A new Method for the Estimation of Common Wheat in Pasta Products». Lebensm. Wis. U. Technol. Vol. 2. 1969.

20. DETECCIÓN DE HARINAS DEGRADADAS POR EL ATAQUE DE PENTATÓMIDOS

20.1 Principio.

Se detecta la degradación de la calidad panadera de la masa de harina mediante la determinación del exceso de actividad proteolítica.

20.2 Material y aparatos.

Como en 14.2.

20.3 Reactivos.

Como en 14.3.

20.4 Procedimiento.

Como el 14.4 con las siguientes modificaciones:

20.4.1 El número de piezas de masa serán seis.

20.4.2 Transcurrido el tiempo normal de 26 minutos del comienzo de amasado, extraer tres piezas de la cámara del alveógrafo y analizarlas obteniendo sus correspondientes curvas. El resto de las piezas se analizan sobre el mismo papel después de un periodo de reposo de tres horas.

Si alguno de los alveolos o curvas fuera claramente anormal debe desecharse la curva.

20.5 Expresión de los resultados.

Si existe una actividad proteolítica excesiva, la segunda serie de curvas presentará menor extensibilidad y tenacidad, siendo mayor la diferencia entre ellas, a mayor actividad.

Cuantificar esta actividad calculando la degradación de W y G en la forma siguiente:

Calcular los valores de estos índices por separado para la primera serie de curvas (con tiempo de reposo normal) Wo y Go y para la segunda (con tiempo de reposo de 3 horas) W₁ y G₁.

 

20.6 Referencias.

1. Harinas. Actividad proteolítica. H-80277-A. Ministerio del Aire.