ANEXO

ANEXO

Método analítico

Compuestos polares en aceites y grasas calentados

1. Principio.

Separación de las grasas calentadas por cromatografía en columna, en compuestos polares y no polares. Elución de los no polares. Determinación de los polares por cálculo de la diferencia entre el peso de la muestra añadida a la columna y la fracción no polar eluida.

El método evalúa el grado de deterioro de grasas calentadas. Los compuestos polares incluyen sustancias tales como monoglicéridos, diglicéridos, ácidos grasos libres presentes en grasas no calentadas, así como productos transformados durante el calentamiento de la grasa. Los compuestos no polares son principalmente triglicéridos inalterados.

Es aplicable a todos los aceites y grasas, tanto animales como vegetales.

2. Material y aparatos.

2.1 Balanza analítica con una precisión de 0,1 mg.

2.2 Columna cromatográfica de vidrio, de 21 mm de diámetro interno, 450 mm de longitud, con llave de teflón y boca esmerilada.

2.3 Embudo de decantación de 250 ml de capacidad, con junta esmerilada, adaptable a la columna 2,2.

2.4 Equipo de cromatografía en capa fina que incluya:

2.4.1 Cubeta de desarrollo.

2.4.2 Placas cromatográficas de 20 x 20 cm, con capa de silicagel 0,25 mm de espesor, sin indicador de fluorescencia.

2.4.3 Pulverizador para revelado de placas.

2.5 Estufa de secado que permita alcanzar temperaturas de hasta 160 ºC ∙ 2 ºC.

2.6 Evaporador rotatorio.

3. Reactivos.

3.1 Éter de petróleo de punto de ebullición 40-60 ºC.

3.2 Etanol, al 95 por 100 (v/v).

3.3 Cloroformo,

3.4 Éter etílico, libre de peróxidos y de residuo.

3.5 Ácido acético glacial.

3.6 Solución eluyente: Mezcla de éter de petróleo (3.1) y éter etílico (3.4) 87/13, (v/v).

3.7 Líquido de desarrollo: Mezcla de éter de petróleo (3.1), éter etílico (3.4) y ácido acético (3.5), 70/30/2, (v/v/v).

3.8 Silicagel, tamaño de partícula 0,063-0,200 mm (70-230 mallas). Ajustar a un contenido de agua de 5 por 100 (m/m) como sigue:

Secar en estufa a 160 ºC, por lo menos, durante cuatro horas y enfriar en desecador a temperatura ambiente. Añadir agua hasta alcanzar una humedad del 5 por 100. Tapar el matraz y agitar mecánicamente durante una hora como mínimo.

3.9 Ácido fosfomolíbdico.

3.10 Solución de ácido fosfomolíbdico en etanol (3.2) de 100 g/l.

3.11 Arena de mar, lavada a los ácidos y calcinada.

3.12 Nitrógeno, 99,0-99,8 por 100.

4. Procedimiento.

4.1 Preparación de la muestra.

Calentar las muestras sólidas y semilíquidas ligeramente por encima del punto de fusión y homogeneizar, cuidadosamente, evitando sobrecalentamiento.

Eliminar las impurezas visibles por filtración después de la homogeneización. Si hay agua en la muestra utilizar papel de filtro hidrofóbico.

4.2 Preparación de la columna.

Llenar la columna con alrededor de 30 ml del eluyente. Introducir una bola de algodón en la parte baja de la columna con la ayuda de una varilla y eliminar el aire empujando el algodón.

Preparar en un vaso de precipitados una mezcla de 25 g de silicagel, en unos 80 ml de solución eluyente y verterlo en una columna con la ayuda de un embudo. Para asegurar la completa transferencia del silicagel en la columna, lavar el vaso y las paredes de la columna con eluyente.

Abrir la llave de la columna y dejar correr el eluyente en un segundo vaso hasta que el nivel del mismo quede unos 10 cm sobre el borde del silicagel y cerrar la llave de la columna. Nivelar el silicagel mediante pequeños golpecitos en la columna. Añadir unos 4 gramos de arena de mar y dejar salir el resto de eluyente hasta el nivel de arena.

4.3 Cromatografía de columna.

Pesar con precisión de 1 mg entre 2,4 y 2,6 g de la muestra preparada como se describe en el punto 4.1, en matraz aforado de 50 ml. Disolverlo en aproximadamente 20 ml del eluyente mientras se calienta débilmente. Dejarlo enfriar a temperatura ambiente y llenar hasta el aforo con eluyente.

Introducir con pipeta volumétrica 20 ml de esta solución en la columna preparada como se describe en el punto 4.2, evitando alteraciones de la superficie. Abrir la llave y dejar correr la solución hasta el nivel de la capa de arena. Eluir los compuestos no polares con 150 ml del eluyente recogiéndolos en un matraz de 250 ml previamente tarado, ajustando el flujo de modo que pasen 150 ml a través de la columna en sesenta-setenta minutos.

Eluir los componentes polares con 150 ml de éter etílico, recogiendo el eluido en un segundo matraz de 250 ml previamente tarado.

Evaporar los disolventes en evaporador rotatorio, a temperatura no superior a 60 ºC. Secar en corriente de nitrógeno hasta peso constante.

5. Expresión de los resultados.

El contenido de los compuestos polares, en tanto por 100 (m/m), viene dado por la fórmula:

Cp (%) =	m - m1	x 100
	m

donde:

Cp = Componentes polares.

m_{1 =}Masa, en gramos, de la fracción no polar.

m = Masa, en gramos, de la muestra contenida en los 20 ml de la solución añadida a la columna.

6. Valoración de la eficacia de la columna cromatográfica.

La eficacia de la separación debe ser comprobada por cromatografía en capa fina.

Para ello, diluir las dos fracciones polar y no polar al 10 por 100 en cloroformo y aplicar manchas de 2 microlitros. Introducir la placa en la cubeta y dejarla correr con el líquido de desarrollo. Normalmente después de treinta y cinco minutos el frente ha ascendido unos 17 cm. Sacar la placa y dejar evaporar el disolvente. Pulverizar las placas con la solución de ácido fosfomolíbdico. Después de la evaporación del alcohol, calentar la placa en la estufa a 120-130 ºC hasta la aparición de las manchas. Una correcta eficacia de la columna supone la nítida separación de las dos fracciones.

7. Observaciones.

La obtención de ambas fracciones permite evaluar la recuperación de la muestra. Para muestras conteniendo grandes cantidades de compuestos polares, la recuperación puede ser incompleta. Esto es debido a pequeñas cantidades de sustancias de elevada polaridad que no eluyen bajo las condiciones especificadas.

8. Referencias.

IUPAC-AOAC, Journal ASSOC. OFF. ANAL CHEM. Volumen 64, número 6, 1981, página. 1329.