Legislación › Real Decreto 1347/1992, de 6 de noviembre, por el que se modifican las normas de lucha contra la peste equina y se establecen las condiciones de sanidad animal que regulan los movimientos intracomunitarios de équidos y las importaciones de estos animales procedentes de países terceros.
ANEXO D
ANEXO D
Peste equina
Diagnóstico
Fijación del complemento
El antígeno se prepara a partir de cerebros de ratón de un mes que hayan recibido la inoculación intracerebral de una cepa neurotropa de virus. Esto puede efectuarse mediante el método siguiente de Bourdin:
Los cerebros se congelan y después se machacan en un tampón verinal a razón de 10 cerebros por 12 mililitros de tampón. La suspensión resultante debe centrifugarse durante una hora a 10.000 r/min a 4 ºC. Lo que sobrenada es el antígeno. Se utiliza preferentemente sin ninguna otra modificación pero puede inactivarse mediante B-propiolactona. La inactivación puede efectuarse añadiendo 0,1 mililitros de una solución al 3 por 100 de B-propiolactona en agua destilada a cada fracción de 0,9 mililitros de antígeno y agitando la mezcla durante tres horas a la temperatura del laboratorio bajo campaña ventilada, y luego durante dieciocho horas a 4 ºC. Puede utilizarse también el método de Casals [Casals J. (1949)].
En ausencia de un suero estándar internacional, se graduará el antígeno sobre la base de un suero testigo positivo preparado localmente.
Los sueros se calentarán durante treinta minutos a 60 ºC. Para evitar los efectos anticomplementarios los sueros deberán separarse de la sangre lo más pronto posible, especialmente los sueros de asnos.
En el test se utilizarán sueros testigo positivos y negativos.
Puede emplearse una macrotécnica o una microtécnica. En los dos casos el punto final está representado por un 50 por 100 de hemólisis.
A un volumen de diluciones de dos en dos del suero, añádase un volumen de antígeno como indicado por la graduación de modo que haya dos unidades. Mézclese y déjese reposar quince minutos a la temperatura del laboratorio. Añádanse dos volúmenes de complemento que contenga cinco unidades, mézclese, cúbranse las placas y déjese durante dieciocho horas a 4 ºC. El complemento se graduará en presencia de antígeno para tener en cuenta todos los efectos anticomplementarios. Tras haber dejado reposar las placas durante quince minutos más a la temperatura del laboratorio, añádase un volumen de dilución al 3 por 100 de eritrocitos de cordero sensibilizados. Mézclese y déjese incubar a 37 ºC durante treinta minutos, mezclando de nuevo al cabo de quince minutos de incubación. Si se utilizan placas, centrifúguense las placas durante cinco minutos a 1.500 r/min a 4 ºC.
