ANEXO III

ANEXO III

Procedimiento para la confirmación y diagnóstico diferencial de la enfermedad de Newcastle

Los siguientes procedimientos de aislamiento y caracterización de los virus de la enfermedad de Newcastle han de considerarse como directrices y constituyen los requisitos mínimos que deben aplicarse en el diagnóstico de dicha enfermedad.

El virus responsable de la enfermedad de Newcastle es la especie tipo de la familia «Paramyxoviridae». Hasta ahora, existen nueve grupos serológicamente diferenciables de paramixovirus aviarios, que se han denominado PMV-1 a PMV-9. Todos los virus de la enfermedad de Newcastle se sitúan en el grupo PMV-1. A los efectos de los procedimientos de diagnóstico para la confirmación y el diagnóstico diferencial de la enfermedad de Newcastle, se empleará la siguiente definición:

Por enfermedad de Newcastle se entiende una infección producida por cualquier cepa aviaria del paramixovirus 1, con un índice de patogenicidad intracerebral (IPIC) superior a 0,7 en pollitos de un día de edad.

CAPÍTULO I

Toma de muestras y tratamiento de las mismas

1. Muestras.

Escobillados de cloaca (o materias fecales) y escobillados traqueales de aves enfermas; materias fecales o contenido intestinal, tejido cerebral, tráquea, pulmones, hígado, bazo y otros órganos manifiestamente afectados procedentes de aves recién fallecidas.

2. Tratamiento de las muestras.

Aunque los órganos y los tejidos mencionados en el apartado 1 pueden mezclarse, las materias fecales deberán tratarse por separado. Se sumergirán completamente los escobillados en una cantidad suficiente de medio con antibióticos. A su vez, las muestras de materias fecales y de órganos deberán homogeneizarse (en un mezclador cerrado o utilizando una mano y un mortero y arena esterilizada) en un medio con antibióticos para convertirlas en suspensiones en ese medio al 10-20 por 100 p/v. Posteriormente, esas suspensiones se dejarán a temperatura ambiente durante dos horas aproximadamente (o durante más tiempo a una temperatura de 4 Grad. ºC) y se clarificarán por centrifugación (por ejemplo, de 800 a 1.000 g durante diez minutos).

3. Medio con antibióticos.

Diferentes laboratorios han utilizado distintos medios con antibióticos, con buenos resultados. El laboratorio enumerado en el anexo IV podrá asesorar al respecto. Para las muestras de materias fecales es necesaria una fuerte concentración de antibióticos; así, una mezcla típica es la siguiente: 10.000 unidades/ml de penicilina, 10 mg/ml de estreptomicina, 0,25 mg/ml de gentamicina y 5.000 unidades/ml de micostatina en una solución salina amortiguadora de fosfato. Estos niveles pueden reducirse hasta cinco veces cuando se trabaje con tejidos y escobillados traqueales. Para evitar el crecimiento de Chlamydia, pueden añadirse 50 mg/ml de oxitetraciclina. Al elaborar el medio, es imprescindible comprobar el pH después de añadir los antibióticos y corregirlo hasta que fluctúe entre 7,0 y 7,4.

CAPÍTULO II

Aislamiento del virus

Aislamiento del virus en huevos embrionados de gallina.

Deberán inocularse dosis de 0,1 a 0,2 ml del líquido sobrenadante clarificado dentro de la cavidad alantoidea de al menos cuatro huevos embrionados de gallina que hayan sido incubados de ocho a diez días. Es preferible que los huevos procedan de una manada exenta de patógenos específicos, aunque, si ello no fuera posible, podrán utilizarse huevos de una manada exenta de anticuerpos del virus de la enfermedad de Newcastle. Los huevos inoculados deberán mantenerse a 37 Grad. ºC y se examinarán al trasluz diariamente. Los huevos que contengan embriones muertos o moribundos serán refrigerados a 4 Grad. ºC a medida que se vayan comprobando. Los demás lo serán a la misma temperatura seis días después de la inoculación. Los fluidos alantoideos o amnióticos se someterán además a la prueba de hemaglutinación. Si la prueba de hemaglutinación resultase negativa, deberá repetirse el procedimiento anterior utilizando fluido alantoideo o amniótico no diluido, como inóculo.

Cuando la hemaglutinación sea positiva, deberá descartarse la posible presencia de bacterias mediante la realización de un cultivo. Si se confirma la presencia de bacterias, podrán filtrarse los fluidos con un filtro de membrana de 450 nm, añadirse más antibióticos e inocularse en huevos embrionados como ya se explicó anteriormente.

CAPÍTULO III

Diagnóstico diferencial

1. Diferenciación preliminar.

Todos los virus hemaglutinantes deberán enviarse al laboratorio nacional para su completa identificación y caracterización y para ser objeto de pruebas de patogenicidad. No obstante, como es fundamental que se adopten, lo antes posible, medidas provisionales para limitar la extensión de la enfermedad de Newcastle, los laboratorios regionales deberán ser capaces de detectar el virus de dicha enfermedad. Por ello, los fluidos hemaglutinantes deberán someterse a las pruebas de inhibición de la hemaglutinación descritas en los capítulos 5 y 6. Una inhibición positiva, es decir de 2⁴ o más, con antisuero policlonal específico para el virus de la enfermedad de Newcastle (con un título conocido de al menos 2⁹), se considerará una identificación preliminar suficiente para imponer medidas provisionales para la lucha contra la enfermedad.

2. Confirmación.

Un laboratorio nacional deberá efectuar un diagnóstico diferencial completo de todos los agentes hemaglutinantes. La presencia del virus de la enfermedad de Newcastle volverá a confirmarse por inhibición realizando pruebas de inhibición de la hemaglutinación con antisueros de gallina monoespecíficos. Todo el material positivo deberá someterse a la prueba del índice de patogenicidad intracerebral con arreglo al procedimiento descrito en el capítulo VII. Los índices de patogenicidad superiores a 0,7 indicarán que la presencia del virus exige la aplicación de todas las medidas de lucha contra la enfermedad.

Gracias a los últimos progresos realizados en materia de tipificación de los virus de la enfermedad de Newcastle, especialmente las técnicas de anticuerpos monoclonales, ha sido posible agrupar las cepas y microorganismos aislados. Concretamente, se dispone de algunos anticuerpos monoclonales específicos para las cepas utilizadas en las vacunas de la Comunidad Europea. Estos anticuerpos pueden emplearse en pruebas sencillas de inhibición de la hemaglutinación.

Dado que a partir de las aves de corral utilizadas como muestra a menudo pueden aislarse vivas las cepas utilizadas en las vacunas, resulta obvia la ventaja de que los laboratorios nacionales puedan identificarlas con rapidez. El laboratorio comunitario de referencia podrá obtener esos anticuerpos monoclonales y facilitárselos a los laboratorios nacionales para que puedan confirmar el aislamiento de los virus utilizados en las vacunas.

Los laboratorios nacionales deberán enviar todos los agentes hemaglutinantes al laboratorio comunitario de referencia, a través del Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación.

3. Tipificación y caracterización adicional de los virus aislados.

Los laboratorios nacionales enviarán al laboratorio comunitario de referencia, a través del Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, todos los virus hemaglutinantes y éste, en consonancia con las funciones y cometidos que le han sido asignados, someterá esos virus a estudios antigénicos y genéticos adicionales para llegar a un mejor conocimiento de la epizootiología de la enfermedad o enfermedades en la Comunidad.

CAPÍTULO IV

Pruebas rápidas para la detección del virus y los anticuerpos de la enfermedad de Newcastle

Pruebas rápidas para la detección del virus de la enfermedad de Newcastle en aves vacunadas y la detección de anticuerpos en aves no vacunadas

1. Detección del virus de la enfermedad de Newcastle.

Se vienen empleando varias pruebas rápidas para detectar directamente los antígenos de la enfermedad de Newcastle en el diágnóstico de infecciones de aves vacunadas; las más extendidas por el momento son la prueba con anticuerpos fluorescentes en secciones longitudinales de la tráquea y la prueba con anticuerpos de la peroxidasa en el encéfalo. No hay motivos para creer que no se pueden aplicar a las infecciones por el virus de la enfermedad de Newcastle otras pruebas de detección directa de antígenos.

Estas pruebas tienen el inconveniente de que no resulta rentable examinar todos los posibles puntos de replicación del virus de la enfermedad de Newcastle en las aves vacunadas. Así, la ausencia de indicios del virus en la tráquea, por ejemplo, no excluye que éste se replique en el intestino. No se recomienda ningún método determinado de detección directa para su uso rutinario, si bien, en determinadas circunstancias, pueden ser de utilidad.

2. Detección de anticuerpos en aves no vacunadas.

La mayoría de los laboratorios que efectúan diagnósticos de la enfermedad de Newcastle conocen la prueba de inhibición de la hemaglutinación. Las recomendaciones que vienen a continuación se refieren a esta prueba para la medición de anticuerpos del virus. No obstante, la prueba de inmunosorción con enzimas (ELISA) puede dar buenos resultados cuando se usa para detectar los anticuerpos del virus. Se aconseja que, cuando los laboratorios regionales deseen servirse de la prueba ELISA, ésta sea supervisada por el laboratorio nacional contemplado en el anexo IV.

a) Muestras.

Deberán tomarse muestras de sangre de todas las aves cuando la manada esté compuesta de menos de 20 animales y muestras de 20 aves cuando la manada sea mayor (de este modo, la probabilidad de detectar al menos un suero positivo será 99 por 100 si el 25 por 100 o más de la manada es positivo, independientemente del tamaño de ésta). Deberá dejarse que la sangre se coagule y se extraerá el suero para la prueba.

b) Examen de los anticuerpos.

Se probará la capacidad de las muestras individuales de suero para inhibir el antígeno hemaglutinante del virus de la enfermedad de Newcastle en pruebas estándar de inhibición de la hemaglutinación efectuadas de acuerdo con el capítulo VI.

Como las opiniones difieren en cuanto a la utilización de cuatro u ocho unidades de hemaglutinina en la prueba de inhibición de la hemaglutinación, y al parecer ambas dosis son válidas, la elección se deja al arbitrio de los laboratorios nacionales. Téngase en cuenta, sin embargo, que del antígeno utilizado dependerá el nivel en el que un suero sea considerado positivo; con cuatro unidades de hemaglutinina, un suero se considerará positivo cuando presente un título superior o igual a 2⁴; mientras que con ocho unidades, el título deberá ser igual o superior a 2³.

CAPÍTULO V

Prueba de hemaglutinación (HA)

Reactivos.

1. Solución salina isotónica amortiguadora de fosfato (0,05 M) de pH 7,0 a 7,4.

2. Hematíes extraídos de un mínimo de tres gallinas exentas de patógenos específicos (a falta de éstas, podrá utilizarse sangre de aves que hayan estado bajo control regular y que estén exentas de anticuerpos del virus de la enfermedad de Newcastle), reunidos y mezclados a partes iguales con solución de Alsever. Antes de utilizarlos, los hematíes deberán lavarse tres veces en la solución salina isotónica amortiguadora de fosfato. Para la prueba se recomienda una suspensión de dicha solución al 1 por 100 (hematíes empaquetados v/v).

3. Se recomienda la utilización como antígeno estándar de la cepa de virus de la enfermedad de Newcastle Ulster 2C.

Procedimiento.

a) Distribuir 0,025 ml de solución salina isotónica amortiguadora de fosfato en cada uno de los pocillos de una placa de microtitulación (utilizar pocillos con fondo en V).

b) Introducir 0,025 ml de suspensión de virus (es decir, fluido alantoideo) en el primer pocillo.

c) Utilizar una micropipeta para hacer diluciones del virus a la mitad (de 1:2 a 1:4096) en toda la placa.

d) Distribuir otros 0,025 ml de solución salina isotónica amortiguadora de fosfato en cada pocillo.

e) Añadir 0,025 ml de una suspensión al 1 por 100 de hematíes a cada pocillo.

f) Homogeneizar golpeando ligeramente la placa y refrigerarla a 4 Grad. ºC.

g) Leer las placas después de treinta o cuarenta minutos, cuando se hayan sedimentado los controles. La lectura se efectuará inclinando la placa y observando la presencia o ausencia de un movimiento de los hematíes en forma de lágrima. Los pocillos en los que no se haya producido la hemaglutinación deberán presentar un movimiento similar al de los pocillos de control que no contengan virus.

h) El título de hemaglutinación será la mayor dilución que produzca la aglutinación de los hematíes. Puede considerarse que tal dilución contiene el título de hemaglutinación. Otro método más preciso para determinar el título de hemaglutinación consiste en realizar pruebas de hemaglutinación con virus en una gama de diluciones iniciales muy cercanas entre sí, por ejemplo, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, etc. Este método se recomienda para preparar con gran precisión antígenos para las pruebas de inhibición de la hemaglutinación (véase el capítulo VI).

CAPÍTULO VI

Prueba de inhibición de la hemaglutinación (IH)

Reactivos (véase el capítulo V).

a) Solución salina isotónica amortiguadora de fosfato.

b) Fluido alantoideo que contenga el virus, diluido con solución salina isotónica amortiguadora de fosfato hasta que contenga 4 u 8 unidades de hemaglutinación por cada 0,025 ml.

c) Suspensión de hematíes de gallina al 1 por 100.

d) Suero de gallina de control negativo.

e) Suero de control positivo.

Procedimiento.

a) Distribuir 0,025 ml de solución salina isotónica amortiguadora de fosfato en cada uno de los pocillos de una placa de microtitulación (utilizar pocillos con fondo en V).

b) Introducir 0,025 ml de suero en el primer pocillo de la placa.

c) Utilizar una micropipeta para hacer diluciones a la mitad del suero en toda la placa.

d) Añadir 0,025 ml de fluido alantoideo diluido que contenga 4 u 8 unidades de hemaglutinación.

e) Homogeneizar golpeando ligeramente la placa y refrigerarla a 4 Grad. ºC, al menos, durante sesenta minutos o dejarla a temperatura ambiente durante treinta minutos, como mínimo.

f) Añadir 0,025 ml de suspensión de hematíes al 1 por 100 a todos los pocillos.

g) Homogeneizar golpeando ligeramente las placas y refrigerarlas a 4 ºC.

h) Leer las placas después de treinta a cuarenta minutos, cuando se hayan sedimentado los hematíes de control. La lectura se efectuará inclinando las placas y observando la presencia o ausencia de un movimiento en forma de lágrima similar al de los pocillos de control que contengan hematíes (0,025 ml) y solución salina isotónica amortiguadora de fosfato (0,05 ml) solamente.

i) El título de inhibición de la hemaglutinación será la mayor dilución del antisuero que produzca una inhibición completa de 4 u 8 unidades de virus (en todas las pruebas deberá incluirse una titulación de hemaglutinación para confirmar la presencia de las unidades de hemaglutinación necesarias).

j) La validez de los resultados dependerá de la obtención de un título de menos de 2³ para cuatro unidades de hemaglutinación o de 2² para ocho unidades de hemaglutinación con el suero de control negativo y de un título de dilución inmediatamente superior o inmediatamente inferior al título conocido del suero de control positivo.

CAPÍTULO VII

Índice de patogenicidad intracerebral (IVPI)

1. Diluir a 1:10 fluido alantoideo recién recogido e infeccioso (el título de hemaglutinación deberá ser superior a 2⁴) en un fluido fisiológico estéril (no podrán utilizarse antibióticos).

2. Inyectar en el cerebro de cada uno de 10 pollitos de un día de edad (es decir, veinticuatro horas y cuarenta horas después de salir del huevo) 0,05 ml de virus diluido. Los pollitos deberán haber nacido de huevos procedentes de una manada exenta de patógenos específicos.

3. Examinar las aves cada veinticuatro horas durante ocho días.

4. Puntuar todas las aves de cada examen: 0 = normal, 1 = enferma y 3 = muerta.

5. Calcular el índice del siguiente modo:

Síntomas clínicos	Días después de la inoculación (número de aves)
	1	2	3	4	5	6	7	8	Total	Puntuación
Normal	10	4	0	0	0	0	0	0	14 x 0	= 0
Enferma	0	6	10	4	0	0	0	0	20 x 1	= 20
Muerta	0	0	0	6	10	10	10	10	46 x 2	= 92
Total .............................................................................................										112
El índice será la puntuación media por ave y por observación = 112/80 = 1.4.

CAPÍTULO VIII

Evaluación de la capacidad de formación de placas

1. Normalmente lo más conveniente es utilizar una serie de diluciones del virus a fin de obtener un número adecuado de placas en el cultivo. Bastará con diluciones decimales hasta llegar a una concentración de 10⁷ en la solución salina isotónica amortiguadora de fosfato.

2. Preparar cultivos confluentes de una capa de células de embrión de gallina o una línea celular apropiada (por ejemplo, la línea de riñón de bovino de Madin-Barby) en placas de Petri de 5 cm de diámetro.

3. Introducir 0,2 ml de cada dilución de virus en dos placas de Petri y esperar treinta minutos para que el virus se absorba.

4. Tras lavar tres veces con la solución salina isotónica amortiguadora de fosfato las células infectadas, se cubrirán con un medio apropiado que contenga agar-agar al 1 por 100 p/v (también puede añadirse 0,01 mg/ml de tripsina). Es importante no añadir suero al medio de recubrimiento.

5. Tras setenta y dos horas de incubación a 37 ºC, las placas habrán alcanzado un tamaño adecuado. Para observarlas, conviene retirar la capa de agaragar y teñir el cultivo de una capa con cristal violeta (0,5 por 100 p/v) en etanol al 25 por 100 (p/v).

6. Todos los virus incubados en un medio que contenga tripsina producirán placas claras. Por el contrario, cuando los medios de cobertura no contengan tripsina, sólo producirán placas los virus virulentos para las gallinas.