ANEXO II

ANEXO II
Método de diagnóstico, detección e identificación de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.
El presente método describe los diversos procedimientos involucrados en:
i) el diagnóstico de la podredumbre parda en tubérculos de patata y de la marchitez bacteriana en plantas de patata y de tomate;
ii) la detección de Ralstonia solanacearumen muestras de tubérculos de patata;
iii) la identificación de Ralstonia solanacearum.
En los apéndices se facilitan detalles para la preparación de los materiales para las pruebas, entre otros, medios nutritivos, tampones, soluciones y reactivos.
SECCIÓN I
Aplicación del método
1. Diagnóstico de la podredumbre parda en los tubérculos de patata y de la marchitez bacteriana en las plantas de patata y de tomate:
El procedimiento de análisis se refiere a los tubérculos de patata que presentan síntomas típicos de la podredumbre parda y a las plantas de patata y de tomate que presentan síntomas típicos o que permiten la sospecha de marchitez bacteriana e incluye una prueba de selección rápida, el aislamiento del patógeno del tejido vascular infectado en un medio de cultivo apropiado y, en caso de resultado positivo, la identificación del cultivo como Ralstonia solanacearum.
Notas:
(1) La descripción de los síntomas se presenta en el punto 1 de la sección II.
(2) Las pruebas de selección rápida facilitan un diagnóstico presuntivo.
Son pruebas adecuadas:
la prueba de la exudación del tejido vascular del tallo (punto 2 de la sección II),
la prueba de detección de gránulos de poli-ß-hidroxibutirato (punto 2 de la sección II),
la prueba IF (punto 2 de la sección III),
la prueba ELISA (punto 3 de la sección III),
la prueba PCR (punto 4 de la sección III).
(3) Aunque el aislamiento del patógeno de material vegetal con síntomas típicos es sencillo mediante siembra de diluciones, el cultivo puede fallar en estados avanzados de infección. Las bacterias saprofitas que crecen en el tejido enfermo pueden enmascarar o inhibir el patógeno en el medio de aislamiento. Si el aislamiento es negativo, pero los síntomas de la enfermedad son los típicos, deberá repetirse el aislamiento, preferentemente valiéndose de una siembra en medio selectivo.
(4) La identificación fiable de un cultivo puro de Ralstonia solanacearumse consigue utilizando al menos una de las pruebas que se enumeran en el punto 4.1 de la sección II, en combinación con una prueba de patogenicidad (punto 4.3 de la sección II). La caracterización de la cepa es facultativa, aunque se recomienda cada vez que se presente un caso nuevo.
2. Detección e identificación de Ralstonia solanacearumen muestras de tubérculos de patata:
El procedimiento se destina a la detección de infecciones latentes en tubérculos de patata mediante una o, preferiblemente, varias pruebas de selección que, de ser positivas, se complementan con el aislamiento del patógeno; en caso de aislamiento de colonias típicas, se procede a continuación a la identificación de un cultivo puro como Ralstonia solanacearum.
Notas:
(1) Tamaño de la muestra: El tamaño normal de la muestra es de 200 tubérculos. Sin embargo, el procedimiento puede adaptarse convenientemente para muestras con menos de 200 tubérculos.
(2) Pruebas de selección: Es posible que una única prueba no sea lo suficientemente sensible o fiable para detectar Ralstonia solanacearum en una muestra. Por ello se recomienda realizar más de una prueba y que se basen en principios biológicos diferentes.
(3) Prueba de inmunofluorescencia (IF): La prueba IF es una prueba de selección plenamente reconocida, lo que supone una ventaja frente a otras pruebas que aún no han sido puestas a punto o convalidadas completamente. La prueba se usa para otras muchas bacterias, por ejemplo Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Los parámetros de lectura que se especifican en este método hacen que resulte una prueba sensible (con límites de detección de 103-104 células por ml de precipitado resuspendido). Se prefiere el método indirecto. El método directo puede aplicarse si la prueba tiene un grado de sensibilidad y especificidad equivalente al del método indirecto.
El factor crítico en que se basa la fiabilidad de los resultados es la calidad del antisuero. Sólo es aceptable un antisuero con un título elevado (2000, como mínimo, para el antisuero crudo) y todas las pruebas deben realizarse a la dilución del título del antisuero o con una dilución por debajo de éste.
La prueba IF presenta la ventaja de la interpretación subjetiva de la morfología de la tinción celular y de la intensidad de la fluorescencia, que facilitan información sobre la especificidad de la reacción. Son frecuentes las reacciones cruzadas producidas por bacterias serológicamente afines, procedentes del suelo o asociadas a tejidos de la patata, con morfología celular de Ralstonia solanacearum. Aunque la prueba IF puede utilizarse como única prueba de selección, cuando se sospeche que se han producido reacciones cruzadas convendrá efectuar una prueba de selección alternativa basada en principios biológicos diferentes. En tales casos la siembra en medio selectivo es la prueba más adecuada.
(4) Pruebas de siembra en medio selectivo: El medio SMSA modificado y el procedimiento que se especifican en este método hacen que ésta sea una prueba sensible y selectiva para la detección de Ralstonia solanacearum, cuyos resultados pueden conocerse de tres a seis días después de la siembra. El agente patógeno se obtiene directamente en cultivo y puede identificarse fácilmente. Para poder aprovechar plenamente el potencial de la prueba, es necesario preparar con cuidado las cuñas para evitar otras bacterias asociadas al tubérculo de la patata que compiten con Ralstonia solanacearum en el medio y pueden afectar el desarrollo del agente patógeno. Algunas cepas pueden crecer insuficientemente, ya que los componentes del medio pueden afectar al organismo buscado. Asimismo, debe tenerse cuidado para diferenciar Ralstonia solanacearum de otras bacterias que pueden desarrollarse en el medio. Aunque la siembra en medio selectivo puede utilizarse como única prueba de selección, cuando se obtengan resultados negativos y se sospeche que se ha producido una inhibición del crecimiento de Ralstonia solanacearum, debido a la presencia de otras bacterias en el medio, será conveniente realizar una segunda prueba de selección. En tal caso, la prueba IF será la más apropiada.
(5) Prueba ELISA: En general, la prueba ELISA es menos sensible que la prueba IF (límites de detección: 104-105 células por ml de precipitado de extracto de patata). Se trata de una prueba barata y rápida, que, no obstante, en lo que a resultados se refiere, está en general más expuesta a dar resultados falsos positivos (reacciones cruzadas) y falsos negativos (inhibición causada por moléculas fenólicas presentes en el extracto de patata). El antisuero debe poseer una especificidad muy elevada. La prueba ELISA no puede utilizarse como única prueba de selección.
(6) Prueba PCR: Esta prueba posee el potencial necesario para una gran sensibilidad de detección, pero puede ser inhibida fácilmente por componentes del extracto de planta o tubérculo, con el consiguiente resultado falso negativo. Algunos cultivares de patata contienen más inhibidores que otros, que es necesario eliminar. La inhibición puede reducirse mediante dilución, si bien con ello se diluyen también las poblaciones de Ralstonia solanacearum. Debe tenerse mucho cuidado en todas las fases de preparación de las muestras y de la prueba para evitar contaminaciones que darían lugar a resultados positivos falsos. También pueden darse resultados falsos positivos debido a secuencias homólogas de otros organismos. De ahí que la prueba PCR directa no pueda utilizarse como única prueba de selección.
(7) Prueba de enriquecimiento: La incubación de muestras de extracto de patata en un caldo semiselectivo, como el caldo SMSA modificado, permite la multiplicación de Ralstonia solanacearum y, lo que es más importante quizás, también diluye los inhibidores potenciales de las pruebas ELISA o PCR. De este modo, Ralstonia solanacearum puede detectarse mediante las pruebas IF, ELISA y PCR en un caldo de enriquecimiento. No recomendamos la realización de cultivos directos a partir de caldos enriquecidos, ya que estos métodos de enriquecimiento no se han ensayado y probado a fondo. Si se incluyen aquí es porque poseen un potencial considerable. No obstante, debido a la relativa falta de experiencia que se tiene de ellos, no pueden utilizarse como métodos de detección únicos.
(8) Prueba de bioensayo: La prueba de bioensayo se usa para el aislamiento de Ralstonia solanacearum a partir de extracto de patatas mediante enriquecimiento selectivo de la bacteria en una planta huésped, y puede realizarse en plantas de tomate o en berenjenas. Exige que las condiciones de incubación sean óptimas, según se especifican en este método. Es muy probable que las bacterias inhibidoras de Ralstonia solanacearum en medio SMSA no interfieran en esta prueba.
(9) Pruebas confirmatorias: La identificación fiable de un cultivo puro de Ralstonia solanacearumse efectúa mediante alguna de las pruebas que se enumeran en el punto 4.1 de la sección II, en combinación con una prueba de patogenicidad (punto 4.3 de la sección II). Aunque la caracterización de la cepa es optativa, se recomienda en cada caso nuevo.
SECCIÓN II
Diagnóstico de la podredumbre parda en los tubérculos de patata y de la marchitez bacteriana en las plantas de patata y de tomate
1. Síntomas:
1.1 Síntomas en la patata:
En la planta. La fase inicial de la infección se caracteriza por un marchitamiento de las hojas en progresión ascendente hacia el extremo superior de la planta, bajo el efecto de las temperaturas diurnas altas, con una recuperación durante la noche. El marchitamiento se hace rápidamente irreversible y ocasiona la muerte de la planta. El tejido vascular de los tallos de las plantas marchitadas cortados transversalmente puede volverse pardo, y en la superficie del corte suele observarse un exudado mucoso blanquecino o éste puede extraerse apretando el tallo. Si se coloca verticalmente un tallo cortado en agua, de los haces vasculares salen hilos viscosos de dicho exudado.
En el tubérculo. Los tubérculos de patata deben cortarse transversalmente cerca de la parte basal (estolón). En la fase inicial de la infección se produce una decoloración entre amarillo vítreo y pardo claro de la línea vascular, de la cual suele fluir espontáneamente un exudado mucoso crema pálido al cabo de varios minutos o cuando se hace una ligera presión con los pulgares en la piel próxima a la superficie del corte. Posteriormente, la decoloración vascular adquiere un tono pardo más marcado y la necrosis puede extenderse al tejido parenquimático. En las fases avanzadas, la infección progresa desde la parte basal y los ojos, pudiendo dar lugar a que se produzcan en la piel lesiones ligeramente hundidas de color pardo rojizo por las que fluyen bacterias, lo que hace que se adhieran partículas del suelo.
1.2 Síntomas en el tomate:
En la planta. El primer síntoma visible es el aspecto fláccido de las hojas más jóvenes. En condiciones medioambientales favorables para el patógeno (temperatura del suelo de unos 25 oC, humedad saturada) se produce epinastia y marchitamiento de una parte o de la totalidad de la planta en pocos días, que desemboca en el colapso total de la misma. En condiciones menos favorables (temperatura del suelo por debajo de 21 oC) pueden surgir numerosas raíces adventicias del tallo. En ocasiones se observa un cordón grasiento a lo largo del tallo que demuestra la existencia de necrosis en el sistema vascular. Al cortar transversalmente el tallo, los tejidos vasculares del mismo, que presentan una decoloración parda, exudan gotas de líquido bacteriano blanco o amarillento.
2. Pruebas de selección rápida: Las pruebas de selección rápida facilitan un diagnóstico presuntivo. Realícese una o más de las siguientes pruebas:
Prueba de la exudación del tallo: La presencia de Ralstonia solanacearumen tallos de patata o de tomate marchitos puede evaluarse utilizando la sencilla prueba que se indica a continuación.
Cortar el tallo justo por encima del nivel del suelo. Colocar la superficie del corte en un vaso de precipitados que contenga agua. Poco después, de los haces vasculares saldrán espontáneamente hilos de exudado bacteriano. Este fenómeno no se producirá con ninguna otra bacteria que cause infecciones vasculares en las plantas de patata o de tomate.
Prueba de la detección de gránulos de poli-ß-hidroxibutirato (PHB): Los gránulos de PHB de las células de Ralstonia solanacearum se visualizan tiñendo con azul Nilo A o negro Sudán B.
Preparar un frotis del exudado o del tejido sospechoso en un portaobjetos, o un frotis de un cultivo de 48 horas en YPGA o SPA (apéndice 1). Preparar frotis de control positivo de una cepa de biovar 2 y raza 3 y, si se considera útil, un frotis de un control negativo. Dejar secar. Pasar con rapidez varias veces por la llama la cara inferior del portaobjetos hasta que el frotis quede fijado.
Prueba del azul Nilo:
1. Bañar el frotis fijado con solución acuosa al 1 por 100 de azul Nilo A. Incubar durante 10 minutos a 55 oC.
2. Escurrir la solución de tinción. Lavar suavemente al grifo durante unos instantes. Eliminar el agua sobrante con un pañuelo de papel.
3. Bañar el frotis con ácido acético acuoso al 8 por 100. Incubar durante 1 minuto a temperatura ambiente. 4. Lavar suavemente al grifo durante unos instantes. Secar con un pañuelo de papel.
5. Humedecer de nuevo con una gota de agua.
Tapar con un cubreobjetos.
6. Examinar el frotis tintado con un microscopio equipado con epifluorescencia a 450 nm con aceite de inmersión, a 1.000 aumentos.
Observar si se produce la fluorescencia naranja brillante de los gránulos de PHB. Observar también con la luz normal para cerciorarse de que los gránulos son intracelulares y de que la morfología celular es la típica de Ralstonia solanacearum.
Prueba del negro Sudán:
1. Bañar el frotis fijado con una solución de negro Sudán B al 0,3 por 100 en etanol del 70 por 100. Dejar en incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente.
2. Escurrir la solución de tinción. Lavar suavemente con agua del grifo durante unos instantes. Eliminar el agua sobrante con un pañuelo de papel.
3. Sumergir brevemente el frotis en xilol. Secar con un pañuelo de papel. Precaución al usar el xilol que es un producto nocivo. Trabajar en campana de humos.
4. Bañar el frotis con safranina acuosa al 0,5 por 100 (p/v) y dejar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Precaución al usar la safranina que es un producto nocivo. Trabajar en campana de humos.
5. Lavar suavemente al grifo durante unos instantes. Secar con un pañuelo de papel. Tapar con un cubreobjetos.
6. Examinar la tinción con un microscopio óptico con luz transmitida con aceite de inmersión, a 1.000 aumentos.
Los gránulos de PHB de las células de Ralstonia solanacearum se tiñen de negro azulado, mientras que las paredes de las células lo hacen de rosa.
Otras pruebas: Otras pruebas adecuadas para una selección rápida son la prueba IF (punto 2 de la sección III), la prueba ELISA (punto 3 de la sección III) y la prueba PCR (punto 4 de la sección III).
3. Proceso de aislamiento:
3.1 Coger exudado o pequeñas secciones de tejido decolorado del anillo vascular del tubérculo o de los haces vasculares del tallo de la planta de patata o de tomate. Poner en suspensión en un volumen reducido de agua destilada estéril o en tampón fosfato 50mM. Dejar reposar de 5 a 10 minutos.
3.2 Preparar series de diluciones decimales de la suspensión, por ejemplo 1/10 y 1/100, o más si se considera necesario.
3.3 Añadir un volumen normalizado de la suspensión y de las diluciones a un medio nutritivo general (NA, YPGA y SPA; apéndice 1) y/o a un medio de tetrazolio de Kelman (apéndice 1) y/o a un medio selectivo SMSA (apéndice 7). Extender o hacer estrías con una técnica adecuada de dilución en placas. Si se considera útil, preparar un conjunto de placas distintas con un cultivo de una suspensión celular diluida de una cepa virulenta de Ralstonia solanacearum de biovar 2 y raza 3 que se utilizará como control positivo.
3.4 Dejar en incubación las placas tres días a 28oC. La incubación puede prolongarse hasta seis días si el crecimiento es lento, pero las colonias en SMSA con frecuencia se vuelven atípicas y mueren.
En un medio nutritivo general, los aislados virulentos de Ralstonia solanacearum desarrollan colonias de color blanco nacarado, planas, irregulares y fluidas, que con frecuencia presentan los verticilos característicos.
En el medio de tetrazolio de Kelman, las colonias típicas de aislados virulentos de Ralstonia solanacearum son de color crema, planas, irregulares, con anillos de color rojo sangre en el centro. Las colonias avirulentas de Ralstonia solanacearum son butirosas y de color rojo fuerte.
En el medio SMSA, las colonias típicas de los aislados virulentos de Ralstonia solanacearum son de color blanco lechoso, planas, irregulares y fluidas, y presentan centros de un marcado color rojo sangre.
Las formas avirulentas de Ralstonia solanacearum desarrollan colonias menos fluidas, cuyo color oscila entre completamente rosa y rojo en el medio SMSA.
3.5 Purificar las colonias de morfología característica mediante subcultivo en un medio nutritivo general. Evitar los subcultivos continuos que pueden dar lugar a una pérdida de virulencia.
4. Pruebas de confirmación:
4.1 Identificación de Ralstonia solanacearum: Identificar los cultivos puros de Ralstonia solanacearum mediante uno, como mínimo, de los siguientes procedimientos.
Nota: Incluir los controles adecuados en cada prueba.
Pruebas nutricionales y enzimáticas: Las siguientes propiedades fenotípicas de Ralstonia solanacearum están universalmente presentes o ausentes:
Pigmento fluorescente ·
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Inclusiones de PHB ·
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Prueba O/F ·
O+/F- ·
Catalasa ·
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Oxidasa de Kovacs ·
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Reducción de nitratos ·
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Utilización de citrato ·
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Crecimiento a 40 oC ·
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Crecimiento en NaCl al 1 por 100 ·
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Crecimiento en NaCl al 2 por 100 ·
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Dihidrolasa de arginina ·
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Licuación de gelatina ·
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Hidrólisis del almidón ·
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Hidrólisis de la esculina ·
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Producción de levano ·
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Los medios y métodos se encuentran en Lelliott y Stead (1987).
Prueba IF: Preparar una suspensión de 106 células por ml del cultivo y de las cepas de control positivo. Preparar una serie de diluciones a 1/2 del antisuero. Aplicar el procedimiento de IF (punto 2 de la sección III). El título IF del cultivo debe ser equivalente al del control positivo.
Prueba ELISA: Preparar una suspensión de más de 106 células por ml del cultivo y de las cepas de control positivo. Aplicar el procedimiento ELISA (punto 3 de la sección III). El valor ELISA del cultivo debe ser equivalente al del control positivo.
Prueba PCR: Preparar una suspensión de 106 células por ml del cultivo y de las cepas de control positivo. Aplicar el procedimiento PCR (punto 4 de la sección III). El producto de PCR del cultivo debe tener el mismo tamaño y posteriormente las mismas bandas en el análisis con la enzima de restricción (REA), que el control positivo.
Hibridación fluorescente in situ (Fluorescent in situ hybridisation o FISH): Preparar una suspensión de 106 células por ml del cultivo y de las cepas de control positivo. Aplicar el procedimiento FISH (Van Beuningen et al., 1995) con el iniciador OLI-1 PCR (Seal et al., 1993). El cultivo debe mostrar la misma reacción que el control positivo.
Perfiles de proteínas: Las proteínas de células enteras desnaturalizadas se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) según Stead (1992a).
Perfiles de ácidos grasos (Fatty acid profilingo FAP): Mantener el cultivo y la cepa de control positivo en agar de tripticasa de soja durante 48 horas a 28 oC y aplicar el procedimiento FAP (Janse, 1991; Stead, 1992a; Stead 1992b). El perfil del cultivo debe ser idéntico al del control positivo. En las condiciones especificadas, los ácidos grasos característicos son 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH y 18:1 2OH.
4.2 Caracterización de las cepas: La caracterización de las cepas es optativa, pero se recomienda en cada caso nuevo, utilizando, al menos, unas de las pruebas siguientes:
Determinación de los biovares: Ralstonia solanacearum se divide en biovares en función de la capacidad de producir ácido de tres hexosas alcohólicas y tres azúcares (Hayward, 1964 y 1994).
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Biovar ·
1 ·
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3 ·
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5 ·
Utilización de: ·
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Maltosa ·
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Lactosa ·
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Celobiosa ·
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Mannitol ·
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Sorbitol ·
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Dulcitol ·
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El biovar 2 se diferencia en subfenotipos mediante pruebas adicionales (Hayward, 1994):
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Biovar 2 ·
Biovar 2-A ·
Biovar 2-T ·
Utilización de trehalosa. ·
- ·
+ ·
+ ·
Utilización de inositol.. ·
+ ·
- ·
+ ·
Utilización de D-ribosa. ·
- ·
- ·
+ ·
Actividad pectolítica... ·
baja ·
baja ·
alta ·
Determinación de las razas: La raza (Buddenhagen et al., 1962) puede determinarse con una prueba de patogenicidad en plantas de tomate o en berenjenas y en plantas de tabaco, y mediante una reacción de hipersensibilidad (HR) en hojas de tabaco (Lozano y Sequeira, 1970):
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Raza (*) ·
1 ·
2 ·
3 ·
Reacción en: ·
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Plantas de tomate/berenjenas. ·
Marchitamiento ·
Sin reacción ·
Marchitamiento ·
Plantas de tabaco. ·
Marchitamiento ·
Sin reacción ·
Sin reacción ·
Hojas de tabaco. ·
Necrosis (48 h) marchitamiento (7-8 días) ·
HR (12-24 h) ·
Clorosis (2-8 días) ·
(*) La raza 4 (patógena en el jengibre y en algún otro huésped) y la raza 5 (patógena sólo en la morera) no están incluidas.
La caracterización de la raza a través de pruebas de patogenicidad o hipersensibilidad en hojas de tabaco puede no ser muy fiable, pero podrá ser deducida a partir del biovar y del huésped original.
El cultivo puede caracterizarse aún más mediante lo siguiente:
Obtención de la huella dactilar genómica.
La diferenciación molecular de las cepas en el complejo de Ralstonia solanacearum puede realizarse del modo siguiente:
Análisis RFLP (Cook et al.,1989).
PCR de secuencia repetitiva [REP-, ERIC- & BOX-PCR (Louws et al.,Smith et al.,1995)].
4.3 Prueba de patogenicidad: Esta prueba se destina a confirmar el diagnóstico de Ralstonia solanacearum y comprobar la virulencia de los cultivos identificados como Ralstonia solanacearum.
Preparar un inóculo de 106 células por ml de cultivo y una cepa de control positivo. Inocular de 5 a 10 plantas de tomate o berenjenas, preferentemente en la fase de la tercera hoja verdadera o posterior (punto 6 de la sección III). Dejar en incubación hasta dos semanas entre 22 y 28 oC con alta humedad relativa y riego diario. Observar si se produce marchitamiento y/o epinastia, clorosis o enanismo.
Aislar la bacteria de las plantas sintomáticas de la forma siguiente:
separar secciones del tallo 2 cm por encina del punto de inoculación,
dilacerar y suspender en un pequeño volumen de agua estéril o en tampón fosfato 50mM. Sembrar, dejar en incubación y buscar colonias con morfología típica de Ralstonia solanacearum.
SECCIÓN III
Detección e identificación de Ralstonia solanacearum en muestras de tubérculos de patata
Nota: El tamaño normal de la muestra es de 200 tubérculos. Sin embargo, el procedimiento puede adaptarse convenientemente para muestras con menos de 200 tubérculos.
1. Preparación de la muestra para el análisis:
Observación: El extracto de patata obtenido con este procedimiento puede emplearse también para la detección de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.
Opciones previas al análisis, en caso de considerarlas útiles:
i) incubar la muestra a 25-30 oC durante un período de hasta dos semanas para favorecer la multiplicación de las poblaciones latentes de Ralstonia solanacearum; ii) lavar los tubérculos con agua corriente utilizando desinfectantes y detergentes apropiados. Secar al aire los tubérculos.
1.1 Quitar la epidermis de la parte basal (ombligo) del tubérculo con un bisturí o un cuchillo limpio y desinfectado, de modo que los tejidos vasculares queden a la vista. Extraer con cuidado una pequeña cuña cónica (de 3 a 5 mm de diámetro) de tejido vascular de la parte basal de cada tubérculo. Extraer el mínimo volumen posible de tejido no vascular. Procesar cada uno de los tubérculos de la muestra.
Observación: El examen visual de los tubérculos (punto 1 de la sección II) puede efectuarse en esta fase. Retirar los tubérculos que presenten síntomas o estén muy podridos y analizarlos individualmente (sección II).
1.2 Colocar las cuñas en un recipiente cerrado. Es conveniente procesarlas inmediatamente. De no ser posible, pueden almacenarse durante un período de 24 horas como máximo o, si se mantienen a 4 oC, que no supere las 72 horas.
1.3 Procesar las cuñas por uno de los métodos siguientes:
i) Colocar las cuñas en un recipiente adecuado.
Añadir solución tampón de maceración (apéndice 2) en cantidad suficiente para que las cubra.
Desmenuzarlas en una trituradora Waring Blender o Ultra Thurrax hasta lograr una homogeneización completa pero no excesiva.
Dejar el macerado en remojo de 15 a 30 minutos.
ii) Colocar las cuñas en un recipiente adecuado.
Añadir solución tampón de maceración en cantidad suficiente para que las cubra.
Colocar el recipiente en un agitador rotatorio.
Incubar a 50-100 rpm durante 4 horas a 20-22 oC o durante 16-24 horas a 4 oC. iii) Colocar las cuñas dentro de una bolsa de maceración desechable que sea resistente (por ejemplo, una bolsa Stomacher, de 105 x 150 mm, estéril por radiación).
Machacar con cuidado las cuñas valiéndose de un instrumento adecuado, como, por ejemplo, un martillo, hasta lograr una homogeneización completa.
Añadir solución tampón de maceración en cantidad suficiente para que cubra las cuñas.
Dejar reposar el macerado durante 15-30 minutos.
1.4 Extraer las bacterias de las cuñas procesadas mediante uno de los procedimientos siguientes:
i) Decantar suavemente el macerado en un tubo de centrifugar y dejar los residuos en el recipiente o la bolsa. Si el decantado presenta un aspecto turbio, centrifugar a 180 g, como máximo, durante 10 minutos, a una temperatura inferior a 10 oC.
Centrifugar el decantado o el sobrenadante obtenido en la primera centrifugación, a 7.000 g durante 15 minutos o a 10.000 g durante 10 minutos a una temperatura inferior a 10 oC.
Eliminar el sobrenadante sin perturbar el precipitado.
ii) Filtrar el macerado mediante un sistema de filtración cuyos poros tengan un tamaño de 40-100 mm. Acelerar la filtración utilizando una bomba de vacío.
Recoger el filtrado en un tubo de centrifugar.
Lavar el filtro con un tampón de maceración.
Centrifugar el filtrado a 7.000 g durante 15 minutos o a 10.000 g durante 10 minutos a una temperatura inferior a 10 oC.
Descartar el sobrenadante sin perturbar el precipitado.
1.5 Resuspender el precipitado en 1 ml de tampón de precipitado (apéndice 2).
Dividir en dos partes iguales y poner cada parte en un microvial.
Utilizar un solo microvial para la prueba. Conservar el extracto sobrante a 4 oC durante el análisis.
Añadir glicerol estéril al 10-25 por 100 (v/v) al otro microvial. Homogeneizar por agitación. Guardar a -18 oC (semanas) o a -70 oC (meses).
2. Prueba de inmunofluorescencia (IF): Utilizar un antisuero para Ralstonia solanacearum, de preferencia para raza 3 y biovar 2. Determinar el título en una suspensión de 106 células por ml de la cepa homóloga de Ralstonia solanacearum con una dilución apropiada del conjugado de isotiocianato de fluoresceína (FITC), según las recomendaciones del fabricante. El antisuero crudo debería presentar un título IF de al menos 1:2.000.
Utilizar portaobjetos de pocillos múltiples, de preferencia con 10 pocillos de 6 mm de diámetro como mínimo.
Incluir en cada portaobjetos un control de conjugado FITC. Deberá repetirse la prueba con el control PBS incluido, si se observa alguna célula positiva en el control FITC.
Preparar en otro portaobjetos controles positivos con una suspensión de 106 células por ml de una cepa de raza/biovar adecuados de Ralstonia solanacearum. Incluir un portaobjetos en cada serie de pruebas.
2.1 Preparar los portaobjetos según uno de los procedimientos siguientes:
i) Para precipitados con una cantidad relativamente pequeña de almidón:
Echar con una pipeta un volumen determinado (15 µl es suficiente para pocillos de 6 mm de diámetro; aumentar el volumen si el diámetro es mayor) del precipitado resuspendido en una fila de pocillos. La otra fila puede utilizarse como duplicado o para una segunda muestra, tal como se indica en la figura 1.
ii) Para otros precipitados:
Preparar diluciones decimales, por ejemplo 1/10, 1/100 y 1/1.000, del precipitado resuspendido en tampón de precipitado. Echar con una pipeta un volumen normalizado medido (15 µl es suficiente para pocillos de 6 mm de diámetro; aumentar el volumen si el diámetro es mayor) del precipitado resuspendido y de cada dilución en una fila de pocillos. La otra fila puede utilizarse como duplicado o para una segunda muestra, tal como se indica en la figura 2.
2.2 Dejar secar las gotitas. Fijar las células bacterianas al portaobjetos calentándolo, flameándolo o mediante etanol del 95 por 100.
2.3 Procedimiento IF:
i) Si el portaobjetos se ha preparado según el inciso i) de punto 2.1: Preparar un conjunto de diluciones a 1/2 del antisuero en el tampón IF (apéndice 3): 1/4 del título (T/4), 1/2 del título (T/2), el título (T) y dos veces el título (2T).
ii) Si el portaobjetos se ha preparado según el inciso ii) del punto 2.1: Preparar la dilución de trabajo (DT) del antisuero en el tampón IF. La dilución de trabajo es la dilución del antisuero con especificidad óptima, y normalmente es a la mitad del título.
FIGURA 1
Preparación del portaobjetos según el inciso i) de los puntos 2.1 y 2.3
DILUCIÓN NORMALIZADA DEL PRECIPITADO RESUSPENDIDO
(T=título)
·
FITC ·
T/4 ·
T/2 ·
T ·
2T ·
☐ Diluciones a 1/2 de antisuero ·
Muestra 1 ·
J1 ·
J2 ·
J3 ·
J4 ·
J5 ·
·
Duplicado de la muestra 1 o muestra 2 ·
J6 ·
J7 ·
J8 ·
J9 ·
J10 ·
·
FIGURA 2
Preparación del portaobjetos según el inciso ii) de los puntos 2.1 y 2.3
FITC DILUCIÓN NORMALIZADA DE ANTISUERO
·
Nada ·
Nada ·
1/10 ·
1/100 ·
1/1.000 ·
☐ Dilución decimal precipitado suspendido ·
Muestra 1 ·
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J2 ·
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Duplicado de la muestra 1 o muestra 2 ·
J6 ·
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J10 ·
·
2.3.1 Colocar los portaobjetos en un pañuelo de papel humedecido.
Añadir a los pocillos correspondientes la dilución o diluciones de antisuero. Aplicar PBS en los pocillos FITC. El volumen del antisuero aplicado en los pocillos debe ser equivalente al volumen de extracto aplicado.
2.3.2 Tapar y dejar incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
2.3.3 Sacudir las gotitas de antisuero del portaobjetos y enjuagar cuidadosamente los portaobjetos con tampón IF. Lavar durante 5 minutos con tampón IF-Tween. Repetir la operación con tampón IF (apéndice 3). Eliminar cuidadosamente el exceso de humedad.
2.3.4 Colocar los portaobjetos en un pañuelo de papel humedecido.
Cubrir los pocillos en cuestión y el pocillo FITC con la dilución del conjugado FITC utilizado para determinar el título. El volumen de conjugado aplicado en los pocillos debe ser idéntico al volumen de antisuero aplicado.
2.3.5 Tapar y dejar en incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente.
2.3.6 Sacudir las gotitas de conjugado del portaobjetos. Enjuagar y lavar como antes (2.3.3). Eliminar cuidadosamente el exceso de humedad.
2.3.7 Echar con una pipeta de 5 a 10 µl de tampón fosfato glicerol de 0,1 M (apéndice 3) o un volumen similar en cada pocillo y colocar un cubreobjetos.
2.4 Lectura de la prueba IF:
Examinar los portaobjetos en un microscopio epifluorescente con filtros adecuados para que se produzca la excitación del FITC, con aceite de inmersión y a 500-1.000 aumentos. Recorrer los pocillos a lo largo de dos diámetros perpendiculares entre sí y alrededor del perímetro.
En primer lugar, comprobar el control positivo. Las células deben ser fluorescentes brillantes y estar completamente teñidas.
Nota: La prueba debe repetirse si la tinción no es buena en el control positivo.
Leer los portaobjetos. Observar primero la ausencia de células fluorescentes en los pocillos FITC. Si existieran, indicaría una unión no específica del conjugado, autofluorescencia o contaminación.
Nota: En este caso, repetir la prueba.
Comprobar si hay células fluorescentes brillantes con morfología característica de Ralstoniasolanacearum en los pocillos problema. La intensidad de la fluorescencia debe ser equivalente a la de la cepa de control positivo a la misma dilución del antisuero. Deberán descartarse las células que presenten una tinción incompleta o cuya fluorescencia sea escasa, a menos que haya muchas células de este tipo (véase la interpretación de los resultados de la prueba IF).
Interpretación de los resultados de la prueba IF:
i) La prueba será negativa si en la muestra no se encuentran células fluorescentes brillantes con morfología característica.
ii) Si se encuentran células fluorescentes brillantes con morfología característica, determinar el número medio de células por campo microscópico y calcular el número de células (N) por ml de precipitado resuspendido (apéndice 4).
Se considera que el límite de detección para la prueba IF está alrededor de 103 células por ml de precipitado resuspendido:
en las muestras con NT103 células por ml, la prueba IF se considera positiva,
en las muestras con N≤103 células por ml, la prueba IF puede considerarse positiva.
iii) Si hay un gran número de células (T105 células por ml) incompletamente teñidas o con fluorescencia débil en el título, deberá realizarse una segunda prueba:
bien una prueba basada en un principio biológico distinto,
bien repetir la prueba IF, ya sea con un segundo antisuero o con una dilución decimal del precipitado.
3. Prueba de inmunoabsorción enzimática (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay o ELISA) (basada en Robinson-Smith et al.,1995).
Utilizar antisuero para Ralstonia solanacearum, preferiblemente de la raza 3 y biovar 2. Determinar el título en una suspensión de 106 células por ml de la cepa homóloga de Ralstonia solanacearum
Se recomienda utilizar placas de microtitulación NUNC Polysorp.
Incluir un control negativo de extracto de patata y un control de tampón fosfato salino (PBS).
Utilizar una suspensión de más de 106 células por ml de una cepa de Ralstonia solanacearum biovar 2, raza 3, como control positivo. Procesarlo de la misma manera que la muestra o muestras, pero bien separado de éstas en la placa de microtitulación.
3.1 Echar con una pipeta de 100 a 200 µl del precipitado resuspendido en un microvial.
Calentar durante 4 minutos a 100 oC. Colocar el microvial en hielo.
3.2 Añadir un volumen igual de tampón de tapizado de carbonato de doble concentración (apéndice 5). Homogeneizar por agitación.
3.3 Añadir alícuotas de 100 µl a cada uno de dos pocillos, como mínimo, de la placa de microtitulación.
Dejar en incubación durante una hora a 37 oC o durante una noche a 4 oC.
3.4 Quitar los extractos de los pocillos. Lavar éstos tres veces con PBS-Tween (apéndice 5), dejando en ellos la última solución de lavado durante al menos 5 minutos.
3.5 Preparar la dilución adecuada de antisuero de Ralstoniasolanacearum en tampón de bloqueo (apéndice 5). Echar 100 µl de dilución de antisuero en los pocillos.
Dejar en incubación durante una hora a 37 oC.
3.6 Quitar el antisuero de los pocillos. Lavar éstos como en el punto 3.4.
3.7 Preparar la dilución adecuada de conjugado de fosfatasa alcalina en tampón de bloqueo. Echar 100 µl de dilución de conjugado en los pocillos.
Dejar en incubación durante una hora a 37 oC.
3.8 Quitar el conjugado de los pocillos. Lavar éstos como en los puntos 3.4 y 3.6.
3.9 Preparar la solución de sustrato de fosfatasa alcalina (apéndice 5). Echar 100 µl en los pocillos. Dejar en incubación de 30 minutos a una hora en la oscuridad a temperatura ambiente.
3.10 Leer la absorbancia a 405 nm.
Interpretación de la prueba ELISA: La prueba ELISA será negativa si la densidad óptica (DO) de la muestra es R 2 x DO del control negativo.
La prueba ELISA será positiva si la DO de la muestra es T 2 x DO del control negativo.
4. ;Prueba de polimerización en cadena (Polymerase Chain Reaction o PCR) (Basado en Seal et al., 1993).
Observación: Deberán utilizarse puntas de pipeta ajustadas con filtro en todas las fases de preparación de la muestra y siempre que haya que manejar PCR.
Preparar una suspensión de 106 células por ml de una cepa de Ralstonia solanacearum de raza 3 y biovar 2 como control positivo. Actuar del mismo modo que con la muestra o muestras.
4.1 Echar con una pipeta 100 µl del precipitado resuspendido en un microvial.
Otra alternativa es echar 90 µl del precipitado resuspendido en un microvial que contenga 10 µl de NaOH 0,5 M. Mezclar invirtiendo el vial repetidamente.
4.2 Calentar durante 4 minutos a 100 oC. Colocar el microvial en hielo inmediatamente.
4.3 Preparar, por lo menos, dos diluciones decimales, por ejemplo 1/10 y 1/100, o más si se considera útil, en agua destilada estéril o ultrapura (UPW).
4.4 Preparar la mezcla de reacción PCR (apéndice 6) en un vial estéril añadiendo los componentes siguientes en el orden en que se citan:
Volumen de reacción de 50 µl
Componente ·
Cantidad
—
µl
·
Concentración
final
·
Agua destilada estéril o ultra pura. ·
30,8-33,8 ·
·
10 x tampón PCR ·
5,0 ·
1 x ·
d-ATP ·
1,0 ·
0,2 mM ·
d-CTP ·
1,0 ·
0,2mM ·
d-GTP ·
1,0 ·
0,2 mM ·
d-TTP ·
1,0 ·
0,2 mM ·
Iniciador OLI-1 (20 µM) ·
2,5 ·
1 mM ·
Iniciador Y-2 (20 µM) ·
2,5 ·
1 mM ·
Polimerasa Taq (5 U/µl) ·
0,2 ·
1,0 U ·
Volumen total ·
45-48 ·
·
Para más reacciones:
Calcular la cantidad de cada componente para el número de reacciones necesario.
Mezclar los componentes y poner 45-48 µl de la mezcla en viales PCR estériles.
Colocar los viales con la mezcla de la reacción PCR en hielo.
Para volúmenes de reacción de 25 µl.
Reducir los componentes proporcionalmente.
4.5 Amplificación de la PCR.
4.5.1 Optativo: centrifugar con impulsos los viales que contienen la muestra hervida y el control positivo.
Añadir, en el orden indicado, 2-5 µl de la muestra o muestras, el control de agua y el control positivo a los viales que contienen la mezcla de la reacción PCR. Colocar los viales en el calentador del termociclador de ADN.
4.5.2 Aplicar el siguiente programa: Un ciclo de:
i) Dos minutos a 96 oC: desnaturalización de la cadena molde;
50 ciclos de:
ii) Veinte segundos a 94 oC: desnaturalización,
iii) Veinte segundos a 68 oC: hibridación de iniciador,
iv) Treinta segundos a 72 oC: extensión de la copia;
Un ciclo de:
v) Diez minutos a 72 oC: nueva extensión;
Un ciclo de:
vi) Mantenimiento de la temperatura a 4 oC.
Observación: Estos parámetros son para un aparato Perkin Elmer 9600. Para otros termocicladores tal vez se precise una capa de aceite mineral en los viales de la reacción PCR y/o modificar la duración de las fases ii), iii) y iv) de amplificación.
4.5.3 Retirar los viales del termociclador. Analizar el producto de la PCR. Si esta operación no se realiza inmediatamente, almacenar los viales a 4 oC si se van a utilizar el mismo día o a ‒18 oC, si el período de espera va a ser mayor.
4.6 Análisis del producto de la PCR:
Los fragmentos de la PCR se detectan mediante electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio.
4.6.1 Preparar un gel de agarosa apropiado llevando suavemente la agarosa a ebullición en un tampón de tris-acetato para electroforesis (TAE).
4.6.2 Enfriar la agarosa fundida a 50-60 oC, verterla en el molde de la unidad de electroforesis e insertar el peine. Dejar solidificar el gel.
4.6.3 Retirar el peine. Sumergir el gel en TAE de modo que quede cubierto (2-3 mm) con el tampón.
4.6.4 Poner gotitas de 3 µl de tampón de carga en parafilm. Añadir 12 µl del producto de la PCR procedentes de las muestras, del control positivo o del control de agua, y mezclar aspirando suavemente en la punta de la pipeta antes de la carga. Los volúmenes dados pueden modificarse para que se ajusten a la capacidad de los pocillos en el gel de agarosa.
4.6.5 Cargar con cuidado los pocillos del gel. Incluir un marcador ADN apropiado al menos en un pocillo, para que sirva de referencia.
4.6.6 Conectar los cables al generador de electricidad y al equipo de electroforesis. Dejar correr el gel a 5-8 V/cm hasta que la parte delantera del indicador de seguimiento se halle a 1 cm del final del gel.
4.6.7 Cortar el suministro de electricidad. Desconectar los cables de la unidad de electroforesis.
Retirar el gel con cuidado. Sumergirlo en una solución de bromuro de etidio durante un período comprendido entre treinta y cuarenta y cinco minutos.
Observación: Deben llevarse guantes desechables cada vez que se manipule bromuro de etidio, ya que es un mutágeno muy fuerte.
4.6.8 Desteñir en agua destilada durante 10-15 minutos.
4.6.9 Visualizar el fragmento o los fragmentos de ADN amplificados mediante transiluminación UV. El producto de la PCR de Ralstonia solanacearum con el conjunto de iniciadores OLI-1 e Y-2 tiene una longitud de 288 bp. Cotejar con el marcador de ADN y con el control positivo.
Observación: El control de agua debe ser negativo en cualquier caso. De lo contrario, repetir la prueba.
4.6.10 Hacer una fotografía del gel, en caso de necesitarse una prueba permanente.
4.6.11 Confirmar la autenticidad del fragmento amplificado mediante un análisis de la enzima de restricción (REA).
4.7 Análisis de la enzima de restricción (REA):
4.7.1 Echar 8,5 µl del producto de la PCR (4.5.3) en un microvial nuevo. Añadir 1 µl de tampón de enzima 10 × y 0,5 µl de enzima de restricción AvaII.
4.7.2 Mezclar aspirando suavemente en la punta de la pipeta. Si quedan gotas en las paredes del vial, dar un pulso en una microcentrífuga. Dejar incubar durante una hora a 37 oC.
4.7.3 Analizar el fragmento de la PCR digerido mediante electroforesis en gel de agarosa, tal como se indica en el punto 4.6.
Interpretación de los resultados de la prueba PCR:
La prueba PCR es negativa si no se detecta el fragmento 288 bp característico y si se detecta para la cepa de control positivo de Ralstonia solanacearum.
La prueba PCR es positiva si se detecta el fragmento 288 bp y el análisis REA del fragmento amplificado es idéntico al de la cepa de control positivo de Ralstonia solanacearum.
5. Pruebas de siembra en medio selectivo (basadas en Elphinstone et al., 1996):
5.1 Realizar la prueba mediante una técnica de dilución en placas apropiada, como, por ejemplo:
i) Preparar, al menos, dos diluciones decimales, por ejemplo 1/10 y 1/100, o más, si se considera necesario, del sedimento resuspendido en tampón de precipitado. Echar con una pipeta un volumen normalizado medido (50-100 µl) del sedimento resuspendido y de cada dilución en el medio selectivo SMSA modificado (apéndice 7) y extender con una varilla de vidrio por toda la superficie del medio.
Si se considera útil, realizar también una estría de dilución con un asa cargada con 10 µl del sedimento resuspendido. Flamear el asa entre cada siembra.
ii) Poner un volumen estándar medido (50-100 µl) del sedimento resuspendido en el medio selectivo SMSA modificado y extender con una varilla de vidrio por toda la superficie del medio. Pasar la varilla sin flamearla al menos por otras dos placas de SMSA modificado.
5.2 Añadir, mediante la misma técnica de dilución en placas, una suspensión de 106 células por ml de una cepa de Ralstonia solanacearum de raza 3 y biovar 2 como control positivo a un conjunto diferente de placas de SMSA modificado.
5.3 Dejar incubar las placas a 28 oC. Iniciar su lectura al cabo de tres días. Si el resultado es negativo, esperar hasta seis días como máximo. Los aislados virulentos de Ralstonia solanacearum desarrollan colonias de color blanco lechoso, planas, irregulares y fluidas, con unos centros de color rojo sangre y que pueden presentar rayas o espirales internas.
5.4 Purificar las colonias de morfología característica mediante subcultivo en un medio nutritivo general (apéndice 1).
5.5 Identificar los cultivos puros (punto 4.1 de la sección II) y confirmar los cultivos de Ralstonia solanacearum mediante una prueba de patogenicidad (punto 4.3 de la sección II).
Interpretación de los resultados de la siembra en medio selectivo:
La siembra en medio selectivo es negativa si no se aíslan colonias bacterianas al cabo de seis días ni se aíslan colonias típicas de Ralstonia solanacearum, siempre que no haya sospechas de inhibición producida por colonias de otras bacterias y que en los controles positivos se encuentren colonias típicas de Ralstonia solanacearum.
La siembra en medio selectivo es positiva si se aíslan colonias típicas de Ralstonia solanacearum.
6. Pruebas de bioensayo (basadas en Janse, 1988):
6.1 Utilizar en cada muestra 10 plántulas de tomate o de berenjena de variedades que sean sensibles a Ralstonia solanacearum, en la fase de la tercera hoja verdadera. Las plantas no deben regarse durante las 24 horas previas a la inoculación.
6.2 Distribuir entre las plantas 100 µl de sedimento resuspendido, inoculándolo en el tallo, entre los cotiledones, y en uno o varios puntos más.
6.3 Utilizando esta misma técnica, inocular 10 plántulas con una suspensión de 106 células por ml de una cepa virulenta de Ralstonia solanacearum de raza 3 y biovar 2 como control positivo y con tampón de precipitado como control negativo. Separar físicamente las plantas inoculadas con el control positivo de las otras para evitar contaminaciones.
6.4 Dejar que las plantas sigan creciendo hasta cuatro semanas a 22-28 oC con alta humedad relativa y riego diario. Comprobar si se aprecian síntomas de marchitamiento, epinastia, clorosis y/o crecimiento reducido.
6.5 Aislar de las plantas infectadas (sección II). Identificar los cultivos puros de morfología característica (punto 4.1 de la sección II) y confirmar los cultivos de Ralstonia solanacearum mediante una prueba de patogenicidad (punto 4.3 de la sección II).
6.6 Si se considera útil, comprobar si se ha producido infección en los lotes que no presenten síntomas. Separar del tallo de cada planta una sección de 1 cm que esté 2 cm por encima del punto de inoculación. Homogeneizar los tejidos en tampón de maceración. Llevar a cabo la siembra por dilución en placas (punto 5.1 de la sección III). De obtenerse un resultado positivo, identificar los cultivos puros de morfología característica (punto 4.1 de la sección II) y confirmar la presencia de cultivos de Ralstonia solanacearum mediante una prueba de patogenicidad (punto 4.3 de la sección II).
Interpretación de los resultados de la prueba del bioensayo:
La prueba del bioensayo es negativa si las plantas no están infectadas por Ralstonia solanacearum, siempre que se detecte Ralstonia solanacearumen los controles positivos.
La prueba del bioensayo es positiva si las plantas están infectadas por Ralstonia solanacearum.
7. Pruebas de enriquecimiento (basadas en Elphinstone et al., 1996):
7.1 Echar 100 µl de sedimento resuspendido en 3 ml de caldo SMSA modificado (apéndice 7).
7.2 Dejar incubar a 28 oC durante 48 horas y, en cualquier caso, durante un máximo de 72 horas, manteniendo el tapón del tubo sin apretar para que haya aireación.
7.3 Ajustar el tapón y mezclar. Hacer partes alícuotas para la prueba IF (punto 2 de la presente sección), la prueba ELISA (punto 3 de la presente sección) y/o la prueba PCR (punto 4 de la presente sección).
8. Pruebas de patogenicidad:
Véase el punto 4.3 de la sección II.
APÉNDICE 1
Medios nutritivos para el aislamiento y el cultivo de Ralstonia solanacearum
Agar nutritivo (NA):
Agar nutriente (Difco): 23 g.
Agua destilada: 1 l.
Preparar volúmenes de 0,5 litros del medio en matraces de 1 l.
Disolver los ingredientes.
Esterilizar en un autoclave a 121 oC durante 15 minutos.
Enfriar hasta 50 oC. Distribuir en placas.
Agar levadura peptona glucosa (YPGA):
Extracto de levadura (Difco): 5 g.
Bacto peptona (Difco): 5 g.
D (+) glucosa (monohidrato): 10 g.
Bacto agar (Difco): 15 g.
Agua destilada: 1 l.
Preparar volúmenes de 0,5 l del medio en matraces de 1 l.
Disolver los ingredientes.
Esterilizar en un autoclave a 121 oC durante 15 minutos.
Enfriar hasta 50 oC. Distribuir en placas.
Agar de sacarosa y peptona (SPA):
Sacarosa: 20 g. Peptona: 5 g.
K2HPO4: 0,5 g.
MgSO4 · 7H2O: 0,25 g.
Bacto agar (Difco): 15 g.
Agua destilada: 1 l.
Preparar volúmenes de 0,5 l del medio en matraces de 1 l.
Disolver los ingredientes. Si es necesario, ajustar el pH a 7,2-7,4.
Esterilizar en un autoclave a 121 oC durante 15 minutos.
Enfriar hasta 50 oC. Distribuir en placas.
Medio de tetrazolio de Kelman:
Casamino ácidos (Difco): 1 g.
Bacto peptona (Difco): 10 g.
Dextrosa: 5 g.
Bacto agar (Difco): 15 g.
Agua destilada: 1 l.
Preparar volúmenes de 0,5 litros del medio en matraces de 1 l.
Disolver los ingredientes.
Esterilizar en un autoclave a 121 oC durante 15 minutos.
Enfriar hasta 50 oC.
Añadir una solución acuosa de cloruro de trifenil tetrazolio (Sigma), esterilizada por filtración, para conseguir una concentración final de 50 mg/l. Distribuir en placas.
APÉNDICE 2
Materiales para la preparación de muestras
Tampón de maceración: tampón fosfato 50 mM, pH 7,0:
Este tampón se utiliza para macerar tejidos.
Na2HPO4: 4,26 g. KH2PO4: 2,72 g.
Agua destilada: 1 l.
Disolver los ingredientes y comprobar el pH. Preparar las alícuotas necesarias.
Esterilizar en un autoclave a 121 oC durante 15 minutos.
Para la realización de la prueba PCR directa, se recomienda añadir polivinilpirrolidona-40.000 MWT (PVP-40) al 5 por 100, para reducir la incidencia de la inhibición de amplificación por moléculas aromáticas presentes en el extracto.
En el caso de utilizarse los procedimientos de homogeneización con Waring Blender o con Ultra Turrax para la maceración de los tejidos de patata, se recomienda la utilización de un defloculante, un agente antiespumante o un antioxidante.
Copos de lubrol: 0,5 g/l.
Antiespumante DC silicona: 1,0 ml/l.
Tetrasodiopirofosfato: 1,0 g/l.
Esterilizar separadamente en un autoclave. Añadir hasta obtener la concentración deseada.
Tampón del precipitado: tampón fosfato 10 mM, pH 7,2:
Este tampón se utiliza para la resuspensión y dilución de los precipitados y de las cuñas de patata.
Na2HPO4 · 12H2O: 2,7 g. NaH2PO4 · 2H2O: 0,4 g.
Agua destilada: 1 l.
Disolver los ingredientes y comprobar el pH. Preparar las alícuotas necesarias.
Esterilizar en un autoclave a 121 oC durante 15 minutos.
APÉNDICE 3
Materiales para la prueba IF
Tampón IF: tampón fosfato salino (PBS) 10 mM, pH 7,2:
Este tampón se utiliza para la dilución de antisueros.
Na2HPO4 · 12H2O: 2,7 g.
NaH2PO4 · 2H2O: 0,4 g.
NaCl: 8,0 g.
Agua destilada: 1 l.
Disolver los ingredientes y comprobar el pH. Preparar las alícuotas necesarias.
Esterilizar en un autoclave a 121 oC durante 15 minutos.
Tampón IF-Tween:
Este tampón se utiliza para lavar los portaobjetos. Añadir 0,1 por 100 de Tween 20 al tampón IF.
Tampón fosfato glicerol 0,1 M, pH 7,6:
Este tampón se utiliza como fluido de montaje en los pocillos de los portaobjetos de IF para aumentar la fluorescencia.
Na2HPO4 · 12H2O: 3,2 g. NaH2PO4 · 2H2O: 0,15 g.
Glicerol: 50 ml.
Agua destilada: 100 ml.
APÉNDICE 4
Determinación del nivel de contaminación en la prueba IF
Superficie (S) del pocillo del portaobjetos múltiple
en que D = diámetro del pocillo. ·
[1] ·
Superficie (s) del campo del objetivo
en que d = diámetro del campo. ·
[2] ·
Calcular d bien por medición directa, bien con las fórmulas siguientes:
·
[3] ·
en que
i = coefeciente de campo (depende del tipo del ocular y varía de 8 a 24),
K = coeficiente del tubo (1 ó 1,25),
G = aumento (100x, 40x, etc.) del objetivo.
De [2]:
·
[4] ·
De [3]:
Contar el número de células fluorescentes típicas por campo (c).
Calcular el número de células fluorescentes típicas por pocillo (C):
Calcular el número de células fluorescentes típicas por ml de precipitado (N):
En que = volumen de precipitado en el pocillo,
F= factor de dilución del precipitado.
APÉNDICE 5
Materiales para la prueba ELISA
Tampón carbonato doble para tapizado, pH 9,6:
Na2CO3: 6,36 g.
NaHCO3: 11,72 g.
Agua destilada: 1 l.
Disolver los ingredientes y comprobar el pH. Preparar las alícuotas necesarias.
Esterilizar en un autoclave a 121 oC durante 15 minutos.
Si el extracto contiene una alta proporción de moléculas aromáticas, puede añadirse como antioxidante sulfito de sodio con una concentración final de 0,2 por 100.
Tampón fosfato salino (PBS) 10 x, pH 7,4:
NaCl: 80 g.
KH2PO4: 2 g.
Na2HPO4 · 12H2O: 29 g.
KCl: 2 g.
Agua destilada: 1 l.
Disolver los ingredientes y comprobar el pH. Preparar las alícuotas necesarias.
Esterilizar en un autoclave a 121 oC durante 15 minutos.
Tampón fosfato salino-Tween (PBS-T):
PBS 10 x: 100 ml.
Solución al 10 por 100 de Tween 20: 5 ml.
Agua destilada: 895 ml.
Tampón de bloqueo (anticuerpos) (debe prepararse en el momento de su utilización):
PBS 10 x: 10 ml.
Polivinilpirrolidona-44000 MWT (PVP-44): 2,0 g.
Solución al 10 por 100 de Tween 20: 0,5 g.
Leche en polvo: 0,5 g.
Agua destilada: Hasta completar 100 ml.
Solución de sustrato fosfatasa alcalina, pH 9,8:
Dietanolamina: 97 ml.
Agua destilada: 800 ml.
Mezclar y ajustar el pH a 9,8 con HCl concentrado.
Completar hasta 1 l con agua destilada.
Añadir 0,2 g de MgCl2.
Disolver dos pastillas de 5 mg de sustrato fosfatasa (Sigma) por cada 15 ml de solución.
APÉNDICE 6
Materiales para la prueba PCR
Secuencia del oligonucleótido iniciador:
Iniciador OLI-1: 5’-GGGGGTAGCTTGCTACCTGCC-3’ Iniciador Y-2: 5’CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’ Para los materiales véase Seal et al.,1993.
APÉNDICE 7
Materiales para las pruebas de siembra en medio selectivo y de enriquecimiento
Medio selectivo SMSA (Engelbrecht, 1994, modificado por Elphinstone et al.,1996):
Medio base
Casamino ácidos (Difco): 1 g.
Bacto peptona (Difco): 10 g.
Glicerol: 5 ml.
Agar (Difco): 15 g.
Agua destilada: 1 l.
Preparar volúmenes de 0,5 ls del medio en matraces de 1 l.
Disolver los ingredientes y comprobar el pH. Si es necesario, ajustar el pH a 6,5 antes de esterilizar. Ralstoniasolanacearumno se desarrolla bien con un pH › 7,0.
Esterilizar en un autoclave a 121 oC durante 15 minutos.
Enfriar hasta 50 oC.
Añadir los siguientes ingredientes (todos de Sigma) para obtener las concentraciones finales especificadas:
Violeta cristal: 5 mg/l.
Polimixina B sulfato: 100 mg/l (aproximadamente 600.000 unidades) Sigma P-1004.
Bacitracina (*): 25 mg/l (aproximadamente 1.250 unidades) Sigma B-0125.
Cloranfenicol: 5 mg/l Sigma C-3175.
Penicilina G: 0,5 mg/l (aproximadamente 825 unidades9 Sigma P-3032.
Sales de tetrazolio: 50 mg/l.
Disolver los ingredientes en etanol del 70 por 100 para obtener las concentraciones indicadas para el volumen de diluyente preparado. Algunos ingredientes, como, por ejemplo, la polimixina B y el cloranfenicol, exigen un ligero calentamiento y agitación.
Caldo SMSA (Elphinstone et al.,1996).
Preparar de forma idéntica al medio selectivo SMSA, pero suprimir el agar y las sales de tetrazolio. Distribuir en alícuotas de 3 ml, en tubos desechables Universal de 30 ml.
—————————
(*) Si se considera necesario, el aumento de la concentración de bacitracina hasta 300 ppm puede reducir la contaminación por bacterias saprofitas sin reducir la recuperación de Ralstonia solanacearum.
REFERENCIAS
Buddenhagen, I. W., Sequeira, L., y Kelman, A., 1962: «Description of races in Pseudomonas solanacearum», Phytopathology, número 52, página 726.
Cook, D., Elizabeth, B., y Sequeira, L., 1989: «Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: Detection of restriction fragment length polymorphism with DNA probes that specify virulence and hypersensitive respons», Molecular Plant-Microbe Interactions, número 2, páginas 113-121.
Dinesen, I. G., y DeBoer, S. H., 1995: «Extraction of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus from composite samples of potato tubers», American Potato Journal, número 72, páginas 133-142.
Elphinstone, J. G., Hennessy, J., Wilson, J., y Stead, D. E., 1996: «Sensitivity of different methods for the detection of Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith in potato tuber extracts», EPPO Bulletin, número 26.
Engelbrecht, M. C., 1994: «Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum», ACIAR Bacterial Wilt Newsletter, número 10, páginas 3-5.
Hayward A. C., 1964: «Characteristics of Pseudomonas solanacearum», Journal of Applied Bacteriology, número 27, páginas 265-277.
Hayward A. C., 1994: «Systematic and phylogeny of Pseudomonas solanacearum and related bacteria», Bacterial Wilt: The disease and its causative agent, Pseudomonas solanacearum, A. C. Hayward y G. L. Hartman, eds., Cab International Oxford, páginas 127-135.
Janse, J. D., 1988: «A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity», EPPO Bulletin, número 18, páginas 343-351.
Janse, J. D., 1991: «Infra- and intraspecific classification of Pseudomona ssolanacearum strains using whole cell fatty acid analysis», Systematic and Applied Microbiology, número 14, páginas 335-345.
Kelman, A., 1954: «The relationship of pathogenicity in Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium», Phytopathology, número 64, páginas 293-695.
Lelliot, R. A., y Stead, D. E., 1987: Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants, T.F. Preece ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 216 páginas.
Louws, F. J., Fulbright, D. W., Stephens, C. T., y de Brujin, F. J., 1995: «Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria», Phytopathology, número 85, páginas 528-536.
Lozano, J. C., y Sequeira, L., 1970: «Differentiation of races of Pseudomonas solanacearum by a leaf infiltration technique», Phytopathology, número 60, página 838.
Mirza, M. S., Rademaker, J. W. L., Janse, J. D., y Akkermans, A. D. L., 1993: «Specific 16S ribosomal RNA targeted oligonucleotide probe against Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus»,Canadian Journal of Microbiology, número 39, páginas 1029-1034.
Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J. G., y Forde, S.M.D., 1995: «Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt», Food and Agricultural Immunology, número 7, páginas 67-79.
Seal, S. E., Jackson, L. A., Young, J. P. W., y Daniels, M.J., 1993: «Differentiation of Pseudomonas solanacearum, P. syzygii, P. picketti and the blood disease bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction», Journal of General Microbiology, número 139, páginas 1587-1594.
Smith, J. J., Offord, L. C., Holderness, M., y Saddler, G. S., 1995: «Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya», Applied and Environmental Microbiology, número 61, páginas 4262-4268.
Stead, D. E., 1992a: «Techniques for detecting and identifying plant pathogenic bacteria», Techniques for rapid detection of plant pathogens, J. M. Duncan y L. Torrance, eds., Blackwell Scientific Publications, Oxford, páginas 76-111.
Stead, D. E., 1992b: «Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty acid profiles», International Journal of Systematic Bacteriology, número 42, páginas 281-295.
Van Beuningen, A., Derks, H., y Janse J. D., 1995: «Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in-situ hybridisation (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe», Züchtungsforschung, número 2, páginas 266-269. al
ÁMBITO DE APLICACIÓN DEL MÉTODO
El presente método describe los diversos procedimientos relacionados con:
i) el diagnóstico de la podredumbre parda en los tubérculos de patata y de la marchitez bacteriana en las plantas de patata, tomate y otras plantas huésped,
ii) la detección de Ralstonia solanacearum (R. solanacearum) en muestras de tubérculos de patata, plantas de patata, tomate y otras plantas huésped, agua y suelo,
iii) la identificación de R. solanacearum.
PRINCIPIOS GENERALES
En los apéndices se presentan protocolos optimizados para los diferentes métodos y reactivos validados, así como información detallada para la preparación de materiales de prueba y control. En el apéndice 1 se presenta una lista de los laboratorios que se incluyeron en la optimización y validación de los protocolos.
Habida cuenta de que los protocolos implican la detección de un organismo de cuarentena y de que incluirán la utilización de cultivos viables de R. solanacearum como materiales de control, será preciso llevar a cabo los procedimientos bajo condiciones de cuarentena apropiadas, con instalaciones adecuadas de eliminación de residuos y en aplicación de las condiciones de obtención de los permisos apropiados emitidos por las autoridades oficiales de cuarentena de las plantas.
Los parámetros de las pruebas deben garantizar una detección coherente y reproducible de niveles de R. solanacearum en los límites establecidos en los métodos seleccionados.
Es imprescindible una preparación precisa de los controles positivos.
Asimismo, la realización de pruebas con arreglo a los niveles requeridos implica la utilización de los parámetros correctos, el mantenimiento y el calibrado del equipo, una preservación y manipulación cuidadosa de los reactivos y todas las medidas para evitar la contaminación entre las muestras, como por ejemplo la separación de los controles positivos de las muestras de ensayo. Deben aplicarse normas de control de la calidad para evitar errores administrativos y de otro tipo, especialmente de etiquetado y documentación.
Una sospecha de brote, tal como se menciona en el artículo 5, apartado 2, de este real decreto, implica la obtención de un resultado positivo de las pruebas de diagnóstico o selección efectuadas a una muestra tal como se especifica en los siguientes diagramas de flujo. Un resultado positivo en la primera prueba de selección (prueba IF, PCR/FISH, aislamiento selectivo) debe confirmarse con una segunda prueba de selección basada en un principio biológico diferente.
Si la primera prueba de selección proporciona un resultado positivo, se sospecha entonces la contaminación con R. solanacearum y debe efectuarse una segunda prueba de selección. Si la segunda prueba de selección proporciona un resultado positivo, se confirma entonces la sospecha (sospecha de presencia) y debe continuar la prueba con arreglo al método. Si la segunda prueba de selección proporciona un resultado negativo, se considera entonces que la muestra no está contaminada con R. solanacearum.
Una presencia confirmada, tal como se menciona en el artículo 6, apartado 1, de este real decreto, implica el aislamiento y la identificación de un cultivo puro de R. solanacearum con confirmación de patogenicidad.
SECCIÓN I
APLICACIÓN DEL MÉTODO
1. Método de detección para el diagnóstico de la podredumbre parda y la marchitez bacteriana (R. solanacearum) en tubérculos de patata y plantas de patata, tomate u otras plantas huésped con síntomas de podredumbre parda o marchitez bacteriana
El procedimiento de análisis está destinado a los tubérculos de patata y a las plantas que presentan síntomas típicos de la podredumbre parda o la marchitez vascular o que permiten la sospecha de su presencia. Incluye una prueba de selección rápida, el aislamiento del patógeno del tejido vascular infectado en un medio (selectivo) y, en caso de resultado positivo, la identificación del cultivo como R. solanacearum.
(1) Para la descripción de los síntomas véase la sección II.1.
(2) Las pruebas de diagnóstico rápido facilitan el diagnóstico de presunción, pero no son esenciales. Un resultado negativo no garantiza en todos los casos la inexistencia del patógeno.
(3) En la sección VI.A.1 se describe la prueba de la exudación para el líquido bacteriano del tejido vascular del tallo.
(4) En la sección VI.A.2 se describe la prueba de detección de gránulos de poli-β-hidroxibutirato en células bacterianas.
(5) En la sección VI.A.3 se describen las pruebas de aglutinación serológíca en líquido bacteriano o extractos de tejido sintomático.
(6) En la sección VI.A.5 se describe la prueba IF en líquido bacteriano suspendido en agua o extractos de tejido sintomático.
(7) En la sección VI.A.7 se describe la prueba FISH en líquido bacteriano suspendido en agua o extractos de tejido sintomático.
(8) En la sección VI.A.8 se describe la prueba ELISA en líquido bacteriano suspendido en agua o extractos de tejido sintomático.
(9) En la sección VI.A.6 se describe la prueba PCR en líquido bacteriano suspendido en agua o extractos de tejido sintomático.
(10) El patógeno suele aislarse con facilidad del material vegetal sintomático mediante dilución en placas (sección II.3).
(11) La morfología típica de la colonia se describe en la sección II.3.d.
(12) El aislamiento puede fallar en estados avanzados de infección debido a la competencia o el enmascaramiento por bacterias saprofitas. Sí los síntomas de la enfermedad son los típicos, pero el aislamiento es negativo, deberá repetirse el aislamiento, preferentemente valiéndose de una siembra en medio selectivo.
(13) La identificación fiable de cultivos puros posibles aislados de R. solanacearum, se efectúa utilizando las pruebas descritas en la sección VI.B. La caracterización subespecífíca de las cepas es optativa, pero se recomienda en cada caso nuevo.
(14) La prueba de patogenicidad se describe en la sección VI.C.
2. Método de detección e identificación de R. solanacearum en muestras asintomáticas de tubérculos de patata
Fundamento
El protocolo de análisis tiene por objeto la detección de infecciones latentes en tubérculos de patata. Un resultado positivo de un mínimo de dos pruebas de selección, basadas en diferentes principios biológicos, debe complementarse con el aislamiento del patógeno, seguido, en caso de aislamiento de colonias típicas, por la confirmación de un cultivo puro como R. solanacearum. Un resultado positivo de solamente una de las pruebas de selección no es suficiente para considerar sospechosa la muestra.
Las pruebas de selección y las pruebas de aislamiento deben permitir la detección de 103 a 104 células/ml de precipitado resuspendido, incluidas como controles positivos en cada serie de pruebas.
(1) El tamaño normal de la muestra es de 200 tubérculos, aunque eL procedimiento puede utilizarse con muestras más pequeñas si no se dispone de 200 tubérculos.
(2) En la sección III.1.1 se describen los métodos de extracción y concentración de patógenos.
(3) Si un mínimo de dos pruebas basadas en diferentes principios biológicos proporcionan resultados positivos, debe efectuarse el aislamiento y la confirmación. Efectúese como mínimo una prueba de selección. Cuando esta prueba dé resultados negativos, se considerará que la muestra es negativa. En caso de que la prueba dé resultados positivos, deberá efectuarse una segunda prueba de selección, o varias más, basadas en diferentes principios biológicos, con el fin de verificar el primer resultado positivo. Si la segunda prueba o las pruebas siguientes proporcionan resultados negativos, la muestra se considerará negativa. No será preciso efectuar otras pruebas.
(4) En la sección VI.A.5 se describe la prueba IF.
(5) En la sección VI.A.4 se describe la prueba de aislamiento selectivo.
(6) En la sección VI.A. 6 se describen las pruebas PCR.
(7) En la sección VI.A.7 se describe la prueba FISH.
(8) En la sección VI.A.8 se describen las pruebas ELISA.
(9) En la sección VI.A.9 se describe la prueba del bioensayo.
(10) La morfología típica de la colonia se describe en la sección II. 3. d.
(11) El aislamiento o los bioensayos pueden fallar debido a la competencia o la inhibición por bacterias saprofitas. Si se obtienen resultados positivos claros en las pruebas de selección, pero las pruebas de aislamiento dan resultados negativos, entonces deben repetirse las pruebas de aislamiento a partir del mismo precipitado o tomando más tejido vascular cerca de la parte basal de tubérculos cortados de la misma muestra y, en caso necesario, analizar otras muestras,
(12) La identificación fiable de cultivos puros aislados posibles de R. solanacearum, se efectúa utilizando las pruebas descritas en la sección VI.B.
(13) La prueba de patogenicidad se describe en la sección VI.C.
3. Método de detección e identificación de R. solanacearum en muestras asintomáticas de patatas, tomates y otras plantas huésped
(1) Véase la sección III.2.1 para los tamaños recomendados de las muestras.
(2) En la sección III.2.1 se describen los métodos de extracción y concentración de patógenos.
(3) Si un mínimo de dos pruebas basadas en diferentes principios biológicos proporcionan resultados positivos, debe efectuarse el aislamiento y la confirmación. Efectúese como mínimo una prueba de selección. Cuando esta prueba dé resultados negativos, se considerará que la muestra es negativa. En caso de que la prueba dé resultados positivos, deberá efectuarse una segunda prueba de selección, o varias más, basadas en diferentes principios biológicos, con el fin de verificar el primer resultado positivo, Si la segunda prueba o las pruebas siguientes proporcionan resultados negativos, la muestra se considerará negativa. No será preciso efectuar otras pruebas.
(4) En la sección VI.A.4 se describe la prueba de aislamiento selectivo.
(5) En la sección VI.A.5 se describe la prueba IF.
(6) En la sección VI.A.6 se describen las pruebas PCR.
(7) En la sección VI.A.7 se describe la prueba FISH.
(8) En la sección VI.A.8 se describen las pruebas ELISA.
(9) En la sección VI.A.9 se describe la prueba del bioensayo.
(10) La morfología típica de la colonia se describe en la sección II.3.d.
(11) El aislamiento o los bioensayos pueden fallar debido a la competencia o la inhibición por bacterias saprofitas. Si se obtienen resultados positivos en las pruebas de selección, pero las pruebas de aislamiento dan resultados negativos, entonces deben repetirse las pruebas de aislamiento.
(12) La identificación fiable de cultivos puros posibles aislados de R. solanacearum, se efectúa utilizando las pruebas descritas en la sección VI.B.
(13) La prueba de patogenicidad se describe en la sección VI.C.
SECCIÓN II
MÉTODOS DETALLADOS DE DETECCIÓN DE R. SOLANACEARUM EN TUBÉRCULOS DE PATATA Y PLANTAS DE PATATA, TOMATE U OTRAS PLANTAS HUÉSPED CON SÍNTOMAS DE LA PODREDUMBRE PARDA O LA MARCHITEZ BACTERIANA
1. Síntomas (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)
1.1 Síntomas en patata:
En planta de patata. La fase inicial de la infección en el campo se reconoce por un marchitamiento de las hojas en progresión ascendente hacia el extremo superior de la planta, bajo el efecto de las temperaturas diurnas altas, con una recuperación durante la noche. En las primeras fases del marchitamiento, las hojas siguen estando verdes, pero posteriormente se desarrolla necrosis parda y amarilleo. También se produce epinastia. El marchitamiento de un brote o de plantas enteras se hace rápidamente irreversible y ocasiona el colapso y la muerte de la planta. El tejido vascular de los tallos de las plantas marchitadas cortados transversalmente suele ser pardo, y de la superficie del corte brota un exudado mucoso bacteriano o este puede extraerse apretando el tallo. Si se coloca verticalmente un tallo cortado en agua, de los haces vasculares salen hilos viscosos.
En tubérculo de patata. Los tubérculos de patata deben cortarse transversalmente cerca de la parte basal (estolón) o bien longitudinalmente sobre el estolón. Posteriormente, la decoloración vascular adquiere un tono pardo más marcado y la necrosis puede extenderse al tejido parenquimático. En las fases avanzadas, la infección progresa desde la parte basal y los ojos, por las que pueden fluir exudados bacterianos, lo que hace que se adhieran partículas del suelo. Pueden aparecer en la piel lesiones ligeramente hundidas de color pardo rojizo debido al colapso interno de los tejidos vasculares. En las fases avanzadas de la enfermedad es habitual el desarrollo secundario de podredumbres blandas causadas por hongos y bacterias.
1.2 Síntomas en tomate
En planta de tomate. El primer síntoma visible es el aspecto flácido de las hojas más jóvenes. Si se producen condiciones medioambientales favorables para el patógeno (temperaturas del suelo de 25°C; humedad saturada), en un plazo de pocos días se produce epinastia y marchitamiento de un lado de la planta o de toda ella, lo que desemboca en un colapso total de la planta. En condiciones menos favorables (temperatura del suelo por debajo de 21°C), se produce un menor marchitamiento, pero pueden surgir numerosas raíces adventicias del tallo. En ocasiones se observan estrías húmedas desde la base del tallo, lo que demuestra la existencia de necrosis en el sistema vascular.
Al cortar transversalmente el tallo, los tejidos vasculares que presentan una decoloración parda exudan gotas de líquido bacteriano blanco o amarillento.
1.3 Sintomas en otros huéspedes
Plantas de Solanum dulcamara y S. nigrum. En condiciones naturales, en pocos casos se observan síntomas de marchitamiento en estos huéspedes herbáceos a no ser que la temperatura del suelo supere los 25°C o los niveles de inóculo sean extremadamente elevados (por ejemplo, para S. nigrum que crezca junto a plantas enfermas de patatas o tomates). Cuando se produce el marchitamiento, los síntomas son como los descritos para el tomate. Las plantas de S. dulcamara, que no se marchitan y que crecen con tallos y raíces en el agua, pueden mostrar una decoloración interna pardo claro de los tejidos vasculares en una sección transversal de la base del tallo, o de las partes del tallo que se encuentran bajo el agua. Pueden fluir bacterias de los tejidos vasculares cortados, o formar hilos viscosos, si el tallo cortado se coloca verticalmente en el agua, incluido en caso de inexistencia de síntomas de marchitamiento.
2. Pruebas de selección rápida
Las pruebas de selección rápida facilitan el diagnóstico de presunción, pero no son esenciales. Realícese una o más de las siguientes pruebas validadas:
2.1 Prueba de la exudación del tallo (Véase la sección VI.A.1.)
2.2 Prueba de la detección de gránulos de poli-βhidroxibutirato (PHB)
Los gránulos de PHB característicos en las células de R. solanacearum se visualizan tiñendo frotis de exudado bacteriano fijado con calor procedente de tejido infectado en un portaobjetos con azul Nilo A o negro Sudán B (véase la sección VI.A.2).
2.3 Pruebas de aglutinación serológica (Véase la sección VI.A.3.)
2.4 Otras pruebas
Otras pruebas de selección rápida apropiadas incluyen la prueba IF (véase la sección VI.A.5), la prueba FISH (véase la sección VI.A.7), las pruebas ELISA (véase la sección VI.A.8) y las pruebas PCR (véase la sección VI.A.6).
3. Proceso de aislamiento
a) Coger exudado o secciones de tejido decolorado del anillo vascular del tubérculo o de los haces vasculares del tallo de la planta de patata, de tomate o de otras plantas huésped en proceso de marchitamiento. Poner en suspensión en un volumen reducido de agua destilada estéril o en tampón fosfato 50 mM (apéndice 4) y dejar entre cinco y diez minutos.
b) Preparar una serie de diluciones decimales de la suspensión.
c) Echar 50-100 µl de la suspensión y las diluciones en un medio nutritivo general (NA, YPGA o SPA; véase el apéndice 2) y/o en un medio de tetrazolio de Kelman (apéndice 2) y/o un medio selectivo validado (por ejemplo, SMSA; véase el apéndice 2). Extender o hacer estrías con una técnica adecuada de dilución en placas. Si se considera útil, preparar un conjunto de placas distintas con un cultivo de una suspensión celular diluida de R. solanacearum biovar 2 como control positivo.
d) Incubar las placas entre dos y seis días a 28°C.
– En un medio nutritivo general, los aislados virulentos de R. solanacearum desarrollan colonias de color blanco nacarado, planas, irregulares y fluidas, que con frecuencia presentan los verticilos característicos en el centro. Las formas avirulentas de R. solanacearum forman colonias butirosas pequeñas, redondas y no fluidas, que son completamente blancas.
– En los medios de tretrazolio de Kelman y SMSA, los verticilos son de color rojo sangre. Las formas avirulentas de R. solanacearum forman colonias butirosas pequeñas, redondas y no fluidas, que son totalmente de color rojo oscuro.
4. Pruebas de identificación de R. solanacearum
Las pruebas para confirmar la identidad de presuntos aislados de R. solanacearum se muestran en la sección VI.B.
SECCIÓN III
1. Métodos detallados de detección e identificación de R. solanacearum en muestras asintomáticas de tubérculos de patata
1.1 Preparación de la muestra
Nota:
– El tamaño normal de la muestra es de 200 tubérculos. Un muestreo más intensivo requiere más pruebas en muestras de este tamaño. Un mayor número de tubérculos en la muestra producirá inhibición o una interpretación difícil de los resultados. Sin embargo, el procedimiento puede aplicarse convenientemente a muestras de menos de 200 tubérculos, cuando se disponga de pocos tubérculos.
– La validación de todos los métodos de detección descritos a continuación se basa en la realización de pruebas a muestras de 200 tubérculos.
– El extracto de patata descrito a continuación puede utilizarse también para la detección de la bacteria de la necrosis bacteriana de la patata, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.
Pretratamiento opcional previo a la preparación de la muestra:
a) incubación de muestras a 25-30°C, hasta un máximo de dos semanas antes de la realización de la prueba, con el fin de alentar la multiplicación de cualquier población de R. solanacearum;
b) lavar los tubérculos. Utilizar desinfectantes apropiados (compuestos de cloro cuando vaya a utilizarse la prueba PCR a fin de eliminar el ADN patógeno) y detergentes entre cada muestra. Secar al aire los tubérculos. Este procedimiento de lavado es especialmente útil (pero no obligatorio) para las muestras con exceso de tierra y si debe realizarse una prueba PCR o un procedimiento de aislamiento directo.
1.1.1 Quitar la epidermis de la parte basal (estolón) del tubérculo con un bisturí o un cuchillo limpio y desinfectado, de modo que los tejidos vasculares queden a la vista. Extraer con cuidado una cuña cónica pequeña de tejido vascular de la parte basal y extraer el mínimo volumen posible de tejido no vascular.
(véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/ Public/irc/sanco/Home/main).
Nota: Retirar los tubérculos (podridos) que presenten síntomas sospechosos de «podredumbre parda» y analizarlos por separado.
Si durante la extracción de la cuña de la parte basal se observan síntomas sospechosos de podredumbre parda, deberá efectuarse una inspección visual del tubérculo, y cortarse este cerca de la parte basal. Todo tubérculo cortado con síntomas sospechosos deberá guardarse durante un mínimo de dos días a temperatura ambiente a fin de permitir la suberización y almacenar refrigerado (a 4-10°C) en condiciones de cuarentena apropiadas. Todos los tubérculos, incluidos los que presenten síntomas sospechosos, deberán mantenerse con arreglo a lo establecido en el anexo III.
1.1.2 Colocar las cuñas de la parte basal en recipientes desechables no utilizados que puedan cerrarse y/o sellarse (en caso de reutilización de los recipientes, deberán limpiarse y desinfectarse por completo utilizando compuestos de cloro). Es conveniente procesar las cuñas inmediatamente. Si esto no es posible, almacenarlas en el recipiente, sin añadir ningún tampón, refrigeradas durante un período máximo de 72 horas o de 24 horas a temperatura ambiente.
Procesar las cuñas por uno de los métodos siguientes:
a) bien cubrir las cuñas con un volumen suficiente (aproximadamente 40 ml) de tampón de extracción (apéndice 4) y agitar en un agitador rotatorio (50-100 rpm) durante cuatro horas por debajo de 24°C o refrigeradas entre 16 y 24 horas,
o bien
b) homogeneizar las cuñas con un volumen suficiente (aproximadamente 40 ml) de tampón de extracción (apéndice 4) en una trituradora (por ejemplo, Waring o Ultra Thurax) o machacándolas en una bolsa de maceración desechable sellada (por ejemplo, Stomacher o Bioreba de politeno de gran calibre, 150 mm × 250 mm; esterilizada por radiación) utilizando un mazo de goma o un aparato de trituración adecuado (por ejemplo, Homex).
Nota: Existe un elevado riesgo de contaminación cruzada de muestras cuando se homogenizan las muestras utilizando una trituradora. Tomar precauciones a fin de evitar la generación de aerosoles o el vertido durante el proceso de extracción. Debe asegurarse que se utilizan para cada muestra recipientes y cuchillas de trituradora esterilizados. Si se utiliza la prueba PCR, evitar la transferencia de ADN en los recipientes o el aparato de trituración. Al utilizar PCR, se recomienda machacar el material en bolsas desechables y utilizar tubos desechables.
1.1.3 Se decanta el sobrenadante. Si es demasiado turbio, clarificarlo con una centrifugación a baja velocidad (no más de 180 g durante diez minutos a una temperatura entre 4-10°C) o mediante filtración al vacío (40-100 µm), lavando el filtro con tampón de extracción adicional (10 ml).
1.1.4 Concentrar las bacterias por centrifugación a 7.000 g durante 15 minutos (o 10.000 g durante diez minutos) a una temperatura entre 4-10°C y descartar el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
1.1.5 Resuspender el precipitado en 1,5 ml de tampón de precipitado (apéndice 4). Utilizar 500 µl para pruebas de R. solanacearum, 500 µl para Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus y 500 µl para referencia. Añadir glicerol estéril a la concentración final de 10-25% (v/v) a los 500 µl de la alícuota de referencia y a la restante alícuota de prueba, mezclar y almacenar a una temperatura comprendida entre –16 a –24°C (semanas) o entre –68 a –86°C (meses). Mantener las alícuotas de prueba a entre 4-10°C durante la prueba.
No se aconseja congelar y descongelar repetidamente.
Si debe transportarse el extracto, entréguese en un recipiente frío en un plazo de 24 a 48 horas.
1.1.6 Es de capital importancia tratar por separado todos los controles y muestras positivos de R. solanacearum para evitar la contaminación. Esto se aplica a los portaobjetos IF y a todas las pruebas.
1.2 Análisis
Véase el diagrama de flujo y la descripción de las pruebas y los protocolos optimizados en los apéndices pertinentes:
Aislamiento selectivo (véase la sección VI.A.4)
Prueba IF (véase la sección VI.A.5)
Pruebas PCR (véase la sección VI.A.6)
Prueba FISH (véase la sección VI.A.7)
Pruebas ELISA (véase la sección VI.A.8)
Bioensayo (véase la sección VI.A.9)
2. Métodos detallados de detección e identificación de R. solanacearum en muestras asintomáticas de patatas, tomates y otras plantas huésped
2.1 Preparación de la muestra
Nota: Para la detección de poblaciones latentes de R. solanacearum se aconseja someter a prueba muestras mixtas. El procedimiento puede aplicarse convenientemente a muestras mixtas de hasta 200 partes del tallo. Cuando se efectúen exámenes, deberán basarse en una muestra estadísticamente representativa de la población de plantas investigada.
2.1.1 Colocar segmentos de tallo de 1-2 cm en un recipiente estéril cerrado con arreglo a los siguientes procedimientos de muestreo:
Plántulas de tomate de vivero: con un cuchillo limpio y desinfectado, cortar un segmento de 1 cm de la base de cada tallo, justo por encima del nivel del suelo.
Plantas de tomate cultivadas en el campo o en un invernadero: con un cuchillo limpio y desinfectado, arrancar el brote lateral más inferior de cada planta cortando justo por encima de la unión con el tallo principal. Cortar un segmento de 1 cm del extremo inferior de cada brote lateral.
Otros huéspedes: con un cuchillo limpio y desinfectado o con tijeras de podar, cortar un segmento de 1 cm de la base de cada tallo, justo por encima del nivel del suelo. En el caso de S. dulcamara o de otras plantas huésped que crecen en el agua, cortar secciones de 1-2 cm de los tallos bajo el agua o estolones con raíces acuáticas.
Cuando se muestree un lugar específico, se recomienda analizar una muestra estadísticamente representativa de un mínimo de diez plantas por punto de muestreo de cada huésped herbáceo potencial. La detección del patógeno será más fiable a finales de primavera, en verano y en otoño, aunque las infecciones naturales pueden detectarse durante todo el año en Solanum dulcamara perenne que crece en cursos de agua. Los huéspedes conocidos incluyen plantas de patata espontáneas (groundkeepers), Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium y otros miembros de la familia Solanaceae. Otros huéspedes son Pelargonium spp. y Portulaca oleracea. Entre las especies herbáceas europeas que pueden albergar potencialmente poblaciones de R. solanacearum biovar 2/raza 3 en raíces y/o rizosferas, en condiciones medioambientales específicas, se incluyen: Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp., Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra y Urtica dioica.
Nota: Puede efectuarse en este momento el examen visual para detectar síntomas internos (coloración vascular o líquido bacteriano). Retirar todos los segmentos del tallo con síntomas y analizarlos por separado (véase la sección II).
2.1.2 Desinfectar brevemente los segmentos del tallo con etanol al 70% y secar inmediatamente con un pañuelo de papel. A continuación, procesar los segmentos del tallo mediante uno de los procedimientos siguientes:
a) cubrir los segmentos con un volumen suficiente (aproximadamente 40 ml) de tampón de extracción (apéndice 4) y agitar en un agitador rotatorio (50-100 rpm) durante cuatro horas por debajo de 24°C o refrigerados entre 16 y 24 horas,
o bien
b) procesar inmediatamente machacando los segmentos en una bolsa de maceración resistente (por ejemplo, Stomacher o Bioreba) con un volumen apropiado de tampón de extracción (apéndice 4) utilizando un mazo de goma o un aparato de trituración adecuado (por ejemplo, Homex). De no ser posible, almacenar los segmentos del tallo refrigerados durante un máximo de 72 horas o un máximo de 24 horas a temperatura ambiente.
2.1.3 Desechar el sobrenadante tras 15 minutos de sedimentación.
2.1.4 No suele ser necesaria otra clarificación del extracto o la concentración de la fracción bacteriana, pero puede conseguirse por filtración y/o centrifugación tal como se describe en la sección III.1.1.3 a 1.1.5.
2.1.5 Dividir el extracto de la muestra pura o concentrada en dos partes iguales. Mantener una mitad entre 4 y 10°C durante el análisis y almacenar la otra mitad con glicerol estéril al 10-25% (v/v) entre –16 y –24°C (semanas) o entre –68 y –86°C (mes) en caso de que deban efectuarse nuevas pruebas.
2.2 Análisis
Véase el diagrama de flujo y la descripción de las pruebas y los protocolos optimizados en los apéndices pertinentes:
Aislamiento selectivo (véase la sección VI.A.4)
Prueba IF (véase la sección VI.A.5)
Pruebas PCR (véase la sección VI.A.6)
Prueba FISH (véase la sección VI.A.7)
Pruebas ELISA (véase la sección VI.A.8)
Bioensayo (véase la sección VI.A.9)
SECCIÓN IV
1. Esquema del método de detección e identificación de R. solanacearum en el agua
(1) Véase la sección IV.2.1 para los tamaños recomendados de las muestras.
(2) En la sección IV.2.1 se describen los métodos de concentración de patógenos. La concentración incrementa las poblaciones de patógenos y de bacterias saprofitas competidoras, y únicamente se recomienda si no provoca una inhibición de la prueba de aislamiento.
(3) En la sección VI.A.4 se describe la prueba de aislamiento selectivo.
(4) En la sección VI.A.9 se describe la prueba del bioensayo.
(5) En las secciones VI.A.4.2 y Vl.A.6 se describen los métodos de enriquecimiento PCR.
(6) En las secciones VI.A.4.2 y VI.A.8 se describen los métodos de enriquecimiento ELISA.
(7) La morfología típica de la colonia se describe en la sección II.3.d.
(8) El aislamiento puede fallar debido a la competencia o la inhibición por bacterias saprofitas. Si se sospecha que una elevada población saprofita afecta a la fiabilidad del aislamiento, repetir entonces las pruebas de aislamiento tras la dilución de la muestra en agua estéril.
(9) La identificación fiable de cultivos puros posibles aislados de R. solanacearum, se efectúa utilizando las pruebas descritas en la sección VI.B.
(10) La prueba de patogenicidad se describe en la sección VI.C.
2. Métodos de detección e identificación de R. solanacearum en el agua
Principio
El método validado de detección que se describe en la presente sección es aplicable a la detección del patógeno en muestras de aguas superficiales y puede aplicarse asimismo a las muestras para análisis del proceso de transformación de la patata o de aguas residuales. No obstante, es importante señalar que la sensibilidad previsible de la detección variará en función del sustrato. La sensibilidad de la prueba de aislamiento se ve afectada por las poblaciones de bacterias saprofitas competidoras, que son generalmente muy superiores en el proceso de transformación de la patata y las aguas residuales que en las aguas superficiales. Si bien se espera que el método que se describe a continuación solamente detecte 103 células por litro de aguas superficiales, la sensibilidad de la detección en el proceso de transformación de la patata o las aguas residuales será con toda probabilidad mucho menor. Por este motivo, se recomienda analizar las aguas residuales después de todo tratamiento de purificación (por ejemplo, sedimentación o filtración), durante el cual las poblaciones de bacterias saprofitas se reducen. Deberán tenerse en cuenta las limitaciones de sensibilidad del método de prueba a la hora de evaluar la fiabilidad de cualquier resultado negativo obtenido. Si bien se ha utilizado con éxito este método en trabajos de investigación para determinar la presencia o ausencia del patógeno en las aguas superficiales, deberán tenerse en cuenta sus limitaciones cuando se utilice en investigaciones similares del proceso de transformación de la patata o de aguas residuales.
2.1 Preparación de la muestra
Nota:
– La detección de R. solanacearum en las aguas superficiales es más fiable a finales de primavera, en verano y en otoño, cuando la temperatura del agua supera los 15°C.
– Un muestreo repetido en diferentes momentos durante los períodos mencionados en puntos de muestreo designados incrementará la fiabilidad de la detección al reducir los efectos de la variación climática.
– Ténganse en cuenta los efectos de las fuertes precipitaciones y la geografía del curso de agua a fin de evitar que se produzcan importantes efectos de dilución que puedan ocultar la presencia del patógeno.
– Tomar muestras de agua superficial en las inmediaciones de plantas huésped si estos huéspedes están presentes.
2.1.1 Recoger muestras de agua en puntos de muestreo seleccionados llenando botellas o tubos estériles desechables, a una profundidad, si es posible, por debajo de 30 cm y a 2 m de la orilla. Para los efluentes resultantes de la transformación de la patata y las aguas residuales, recoger muestras en el punto de vertido de las aguas residuales. Se recomiendan las muestras de hasta 500 ml por punto de muestreo. Si se prefieren muestras más pequeñas, se aconseja tomar muestras como mínimo en tres ocasiones por punto de muestreo, cada una de las cuales consistirá en dos submuestras duplicadas de un mínimo de 30 ml. Para un trabajo de investigación intensivo, seleccione como mínimo tres puntos de muestreo por 3 km de curso de agua y asegúrese de que también se toman muestras en los afluentes que desembocan en el curso de agua.
2.1.2 Transportar las muestras en un entorno fresco y oscuro (4-10°C) y analizarlas en un plazo de 24 horas.
2.1.3 Si es preciso, podrá concentrarse la fracción bacteriana utilizando uno de los métodos siguientes:
a) centrifugar 30-50 ml de submuestras de 10.000 g durante diez minutos (o 7.000 g durante 15 minutos), preferiblemente a 4-10°C, descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 ml de tampón de precipitado (apéndice 4);
b) filtración por membrana (tamaño mínimo de los poros de 0,45 µm) y a continuación lavado del filtro en 5-10 ml de tampón de precipitado y retención de los lavados. Este método es adecuado para grandes volúmenes de agua que contengan bajos niveles de saprofitas.
No suele aconsejarse la concentración para muestras del proceso de transformación de la patata o de aguas residuales, ya que unas poblaciones mayores de bacterias saprofitas competidoras inhibirán la detección de R. solanacearum.
2.2 Análisis
Véase el diagrama de flujo y la descripción de las pruebas en los apéndices pertinentes.
SECCIÓN V
1. Esquema del método de detección e identificación de R. solanacearum en el suelo
(1) Véase la sección V.2.1 para los tamaños recomendados de las muestras.
(2) En la sección VI.A.4 se describe la prueba de aislamiento selectivo.
(3) En las secciones VI.A.4.2 y VI.A.6 se describen los métodos de enriquecimiento PCR.
(4) En la sección VI.A.9 se describe la prueba del bioensayo.
(5) La morfología típica de la colonia se describe en la sección II.3.d.
(6) El aislamiento puede fallar debido a la competencia o la inhibición por bacterias saprofitas. Si se sospecha que una elevada población saprofita afecta a la fiabilidad del aislamiento, repetir entonces las pruebas de aislamiento tras la dilución de la muestra.
(7) La identificación fiable de cultivos puros posibles aislados de R. solanacearum, se efectúa utilizando las pruebas descritas en la sección VI.B.
(8) La prueba de patogenicidad se describe en la sección VI.C.
2. Métodos de detección e identificación de R. solanacearum en el suelo
Principios
El método validado de detección que se describe en la presente sección es aplicable a la detección del patógeno en muestras del suelo, pero también puede utilizarse para analizar muestras de residuos sólidos de la transformación de la patata o de lodos de depuradora. No obstante, debe señalarse que estos métodos no son lo suficientemente sensibles para asegurar la detección de poblaciones pequeñas y/o irregularmente distribuidas de R. solanacearum que pueden encontrarse en muestras naturalmente infectadas de estos sustratos.
Deberán tenerse en cuenta las limitaciones de sensibilidad de este método de prueba a la hora de evaluar la fiabilidad de cualquier resultado negativo obtenido, así como cuando se utilice en investigaciones para determinar la presencia o ausencia del patógeno en el suelo o los lodos. El método más fiable para determinar la presencia del patógeno en el suelo del campo es plantar un posible huésped del mismo y supervisar si se produce infección, pero incluso con este método no se detectarán niveles bajos de contaminación.
2.1 Preparación de la muestra
2.1.1 El muestreo del suelo del campo deberá seguir los principios habituales utilizados para el muestreo de nematodos. Para muestrear 0,3 ha, recoger muestras de 0,5 a 1 kg de suelo en 60 puntos a una profundidad de 10 a 20 cm (o de una cuadrícula de 7 × 7 metros). Si se sospecha la presencia del patógeno, incrementar el número de puntos de recogida a 120 por 0,3 ha. Mantener las muestras a una temperatura comprendida entre 12 y 15°C antes del análisis. Tomar muestras de la transformación de la patata y de lodos de depuradora, recogiendo un total de 1 kg de sitios que representen el volumen total de lodos que se analizará. Mezclar adecuadamente cada muestra antes del análisis.
2.1.2 Dispersar submuestras de 10 a 25 g de suelo o lodos mediante agitación rotatoria (250 rpm) en 60-150 ml de tampón de extracción (apéndice 4) durante un máximo de dos horas. En caso necesario, el añadido de 0,02% de Tween-20 estéril y de 10 a 20 g de grava estéril puede contribuir a la dispersión.
2.1.3 Mantener la suspensión a 4°C durante el análisis.
2.2 Análisis
Véase el diagrama de flujo y la descripción de las pruebas en los apéndices pertinentes.
SECCIÓN VI
PROTOCOLOS OPTIMIZADOS PARA LA DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE R. solanacearum
A. PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO Y DETECCIÓN
1. Prueba de la exudación del tallo
La presencia de R. solanacearum en tallos de patata, tomate u otras plantas huésped marchitas puede observarse mediante la sencilla prueba de presunción que se indica a continuación: cortar el tallo justo por encima del nivel del suelo. Suspender la superficie del corte en un tubo de agua limpia. Observar si se produce la característica exudación espontánea de hilos de flujo bacteriano de los haces vasculares cortados unos minutos después.
2. Prueba de la detección de gránulos de poli-βßhidroxibutirato
1. Preparar un frotis de exudado bacteriano procedente del tejido infectado o de un cultivo de 48 horas en un medio YPGA o SPA (apéndice 2) en un portaobjetos.
2. Preparar frotis de control positivos de una cepa de biovar 2 de R. solanacearum y, si se considera útil, un frotis de control negativo de un PHB sp. negativo conocido.
3. Dejar que se seque al aire y pasar con rapidez varias veces por la llama la cara inferior del portaobjetos para fijar los frotis.
4. Teñir el preparado con azul Nilo A o negro Sudán B y observar microscópicamente tal como se describe a continuación.
Prueba del azul Nilo
a) Bañar cada portaobjetos con una solución acuosa de azul Nilo A al 1% e incubar durante diez minutos a 55°C.
b) Escurrir la solución de tinción. Lavar suavemente al grifo durante unos instantes. Eliminar el agua sobrante con un pañuelo de papel.
c) Bañar el frotis con ácido acético acuoso al 8% e incubar durante un minuto a temperatura ambiente.
d) Lavar suavemente al grifo durante unos instantes. Eliminar el agua sobrante con un pañuelo de papel.
e) Rehumedecer con una gota de agua y tapar con un cubreobjetos.
f) Examinar el frotis tintado con un microscopio epifluorescente a 450 nm con gota de aceite de inmersión,a 6001000 aumentos, utilizando un objetivo de inmersión en aceite o agua.
g) Observar si se produce la fluorescencia naranja brillante de los gránulos de PHB. Observar también con la luz normal transmitida para cerciorarse de que los gránulos son intracelulares y de que la morfología celular es la típica de R. solanacearum.
Prueba del negro Sudán
a) Bañar cada portaobjetos con una solución acuosa de negro Sudan B al 0,3% en etanol al 70% e incubar durante diez minutos a temperatura ambiente.
b) Escurrir la solución de tinción y lavar suavemente con agua del grifo durante unos instantes, eliminando el agua sobrante con un pañuelo de papel.
c) Sumergir brevemente los portaobjetos en xilol y secar con un pañuelo de papel. ¡Cuidado!: el xilol es nocivo, deben tomarse las precauciones de seguridad necesarias y debe trabajarse en una campana extractora de humos.
d) Bañar el frotis con safranina acuosa al 0,5% (p/v) y dejar durante diez minutos a temperatura ambiente. ¡Cuidado!: la safranina es nociva, deben tomarse las precauciones de seguridad necesarias y debe trabajarse en una campana extractora de humos.
e) Lavar suavemente al grifo durante unos instantes, secar con un pañuelo de papel y tapar con un cubreobjetos.
f) Examinar los frotis tintados con un microscopio óptico que utilice luz transmitida con aceite de inmersión, a 1000 aumentos, utilizando un objetivo de inmersión en aceite.
g) Observar si los gránulos de PHB de las células de R. solanacearum se tiñen de negro azulado con un teñido rosáceo de las paredes de las células.
3. Pruebas de aglutinación serológica
La mejor manera de observar la aglutinación de células de R. solanacearum en líquido bacteriano o extractos de tejido sintomático es utilizando anticuerpos validados (véase el apéndice 3) etiquetados con marcadores coloreados apropiados tales como células rojas de Staphylococcus aureus o partículas coloreadas de látex. Si se utiliza un equipo comercializado (véase el apéndice 3), siga las instrucciones del fabricante. En caso contrario, aplique el procedimiento siguiente:
a) mezclar gotas de una suspensión de anticuerpos etiquetados y líquido bacteriano (de aproximadamente 5 µl) en pocillos de portaobjetos de pocillos múltiples;
b) preparar controles positivos y negativos utilizando suspensiones de R. solanacearum biovar 2 y una cepa heteróloga;
c) observar si se produce aglutinación en las muestras positivas tras mezclar suavemente durante 15 segundos.
4. Aislamiento selectivo
4.1 Siembra en medio selectivo
Nota: Antes de utilizar este método por primera vez, efectúe pruebas preliminares a fin de garantizar una detección reproducible de 103 a 104 unidades formadoras de colonias de R. solanacearum por ml añadido a extractos de muestras que hayan dado anteriormente resultados negativos.
Utilizar un medio selectivo validado adecuado tal como SMSA (modificado por Elphinstone et al., 1996; véase el apéndice 2).
Es preciso diferenciar R. solanacearum de otras bacterias que pueden desarrollar colonias en el medio. Además, las colonias de R. solanacearum pueden mostrar morfologías atípicas si las placas están superpobladas o si también contienen bacterias antagonistas. Cuando se sospeche la existencia de efectos de la competencia o el antagonismo, deberá volver a analizarse la muestra con otro método.
Para lograr la máxima sensibilidad con este método, utilizar extractos de muestras recién preparados. Sin embargo, este método también puede aplicarse a extractos que se hayan almacenado con glicerol entre –68 y –86°C.
Como controles positivos, preparar diluciones decimales de una suspensión de 106 cfu por ml de una cepa virulenta biovar 2 de R. solanacearum (por ejemplo, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Para evitar toda posibilidad de contaminación, preparar controles positivos totalmente separados de las muestras que van a analizarse.
Deberá examinarse la adecuación para el crecimiento del patógeno de cada lote recién preparado de un medio selectivo antes de utilizarlo para analizar muestras rutinarias.
Procesar el material de control de la misma manera que la muestra o muestras.
4.1.1 Aplicar una técnica de dilución en placas apropiada a fin de garantizar la dilución de cualquier población saprofita formadora de colonias que pudiera existir. Extender 50-100 µl por placa de extracto de muestra y de cada dilución.
4.1.2 Incubar las placas a 28°C. Leer las placas 48 horas después, y posteriormente a diario hasta un máximo de seis días. Las colonias típicas de R. solanacearum en el medio SMSA son de color blanco lechoso, planas, irregulares y fluidas y, tras tres días de incubación, se vuelven de color rosa a rojo sangre en el centro con rayas o espirales internas (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Nota: En algunos casos se forman colonias atípicas de R. solanacearum en este medio. Estas pueden ser pequeñas, redondas, completamente rojas y no fluidas, o sólo parcialmente fluidas y, por tanto, difíciles de distinguir de las bacterias saprofitas formadoras de colonias.
4.1.3 Purificar las presuntas colonias de R. solanacearum tras el estriado o la dilución en placas en un medio nutritivo general a fin de obtener colonias aisladas (véase el apéndice 2).
4.1.4 Almacenar los cultivos a corto plazo en agua estéril (pH 6-8, sin cloro) a temperatura ambiente en la oscuridad, o a largo plazo en un medio crioprotector adecuado entre –68 y –86°C o liofilizado.
4.1.5 Identificar los presuntos cultivos (véase la sección VI. B) y efectuar una prueba de patogenicidad (véase la sección VI. C).
Interpretación de los resultados de la siembra en medio selectivo
La siembra en medio selectivo es negativa si no se observan colonias bacterianas al cabo de seis días ni se encuentran presuntas colonias típicas de R. solanacearum, siempre que no haya sospechas de inhibición producida por la competencia o el antagonismo de otras bacterias y que en los controles positivos se encuentren colonias típicas de R. solanacearum.
La siembra en medio selectivo es positiva si se aíslan presuntas colonias de R. solanacearum.
4.2 Procedimiento de enriquecimiento
Utilizar un medio de enriquecimiento validado como el caldo Wilbrink modificado (véase el apéndice 2).
Este procedimiento puede utilizarse para incrementar selectivamente las poblaciones de R. solanacearum en extractos de muestras e incrementar la sensibilidad de la detección. Asimismo, este procedimiento diluye efectivamente los inhibidores de la reacción PCR (1:100). Sin embargo, debe señalarse que el enriquecimiento de R. solanacearum puede fallar debido a la competencia o el antagonismo de organismos saprofitas, que en muchos casos se enriquecen simultáneamente. Por este motivo, el aislamiento de R. solanacearum a partir de cultivos de caldos enriquecidos puede resultar difícil. Además, debido a que pueden incrementarse las poblaciones de saprofitos serológicamente afines, se recomienda la utilización de anticuerpos monoclonales específicos en lugar de anticuerpos policlonales cuando se aplique la prueba ELISA.
4.2.1 Para el enriquecimiento PCR, transferir 100 µl de extracto de muestras a 10 ml de caldo de enriquecimiento (apéndice 2) previamente alicuotados en tubos o matraces sin ADN. Para el enriquecimiento ELISA, pueden utilizarse proporciones más elevadas de extracto de muestras en el caldo (por ejemplo, 100 µl en 1,0 ml de caldo de enriquecimiento).
4.2.2 Incubar durante 72 horas entre 27 y 30°C en un cultivo agitado o un cultivo estático manteniendo el tapón del tubo sin apretar para que haya aireación.
4.2.3 Mezclar adecuadamente antes de utilizar en las pruebas ELISA o PCR.
4.2.4 Tratar el caldo enriquecido de manera idéntica a la muestra o las muestras de las pruebas anteriormente mencionadas.
Nota: Si se prevé una inhibición o un enriquecimiento de R. solanacearum debido a las elevadas poblaciones de determinadas bacterias saprofitas competidoras, pueden conseguirse mejores resultados con el enriquecimiento de extractos de muestras antes de cualquier centrifugación o con otras medidas de concentración.
5. Prueba de inmunofluorescencia (prueba IF)
Principio
Se recomienda utilizar la prueba IF como principal prueba de selección debido a su capacidad demostrada para alcanzar los límites requeridos.
Cuando se utilice la prueba IF como principal prueba de selección y su lectura sea positiva, deberá efectuarse la prueba de aislamiento, PCR o FISH como segunda prueba de selección. Cuando se utilice la prueba IF como segunda prueba de selección y su lectura sea positiva, deberá efectuarse una nueva prueba con arreglo al diagrama de flujo para completar el análisis.
Nota: Utilizar una fuente validada de anticuerpos de R. solanacearum (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/ Public/irc/sanco/ Home/main). Se recomienda determinar el título para cada nuevo lote de anticuerpos. El título se define como la dilución más elevada en la que se produce una reacción óptima cuando se analiza una suspensión que contenga de 105 a 106 células por ml de la cepa homóloga de R. solanacearum, utilizando un conjugado de isotiocianato de fluoresceína (FITC) apropiado, según las recomendaciones del fabricante. Todo el antisuero policlonal validado debe presentar un título IF de al menos 1:2000. Durante el análisis, deberán utilizarse los anticuerpos en diluciones de trabajo cercanas o equivalentes al título.
La prueba debería efectuarse en extractos de muestras recién preparados. En caso necesario, puede realizarse con éxito enextractos almacenados entre –68 y –86°C en glicerol. El glicerol puede eliminarse de la muestra si se añade 1 ml de tampón de precipitado (véase el apéndice 4), se recentrifuga durante 15 minutos a 7.000 g y se resuspende en un volumen equivalente de tampón de precipitado. En muchos casos no es necesario efectuar este procedimiento, especialmente si las muestras se han fijado en los portaobjetos mediante flameado.
Preparar en otro portaobjetos controles positivos de la cepa homóloga o de cualquier otra cepa de referencia de R. solanacearum, suspendida en extracto de patata, tal como se especifica en el apéndice 3, punto B, y opcionalmente en tampón.
Cuando sea posible, deberá utilizarse tejido naturalmente infectado (mantenido por liofilización o congelación entre –16 y –24°C) como control similar en el mismo portaobjetos.
Pueden utilizarse como controles negativos alícuotas de extracto de muestras que hayan dado anteriormente resultados negativos de R. solanacearum.
En el apéndice 3 se enumeran los materiales normalizados de control positivo y negativo que pueden utilizarse en esta prueba.
Utilizar portaobjetos de pocillos múltiples, de preferencia con diez pocillos de 6 mm de diámetro como mínimo.
Procesar el material de control de la misma manera que la muestra o muestras.
5.1 Preparar los portaobjetos según uno de los procedimientos siguientes
i) Para precipitados con una cantidad relativamente pequeña de sedimento de almidón:
Echar con una pipeta un volumen normalizado medido (15 µl es suficiente para pocillos de 6 mm de diámetro; aumentar el volumen si el diámetro es mayor) de una dilución de 1/100 del precipitado de patata resuspendido en el primer pocillo. A continuación, echar con una pipeta un volumen similar de precipitado sin diluir (1/1) en los pocillos restantes de la fila. La segunda fila puede utilizarse como duplicado o para una segunda muestra, tal como se indica en la figura 1.
ii) Para otros precipitados:
Preparar diluciones decimales (1/10 y 1/100) del precipitado resuspendido en tampón de precipitado. Echar con una pipeta un volumen normalizado medido (15 µl es suficiente para pocillos de 6 mm de diámetro; aumentar el volumen si el diámetro es mayor) del precipitado resuspendido y de cada dilución en una fila de pocillos. La segunda fila puede utilizarse como duplicado o para una segunda muestra, tal como se indica en la figura 2.
5.2 Secar las gotitas a temperatura ambiente o calentándolas entre 40 y 45°C. Fijar las células bacterianas al portaobjetos calentándolo (15 minutos a 60°C), flameándolo con etanol del 95% o con arreglo a las instrucciones específicas de los suministradores de los anticuerpos.
En caso necesario, pueden almacenarse a continuación portaobjetos fijos en un recipiente desecado durante el menor tiempo que resulte necesario (hasta un máximo de 3 meses) antes de efectuar nuevas pruebas.
5.3 Procedimiento IF
i) Si el portaobjetos se ha preparado según el punto 5.1.i):
Preparar un conjunto de diluciones a 1/2. El primer pocillo deberá contener 1/2 del título (T/2), los otros ¼ del título (T/4), 1/2 del título (T/2), el título (T) y el doble del título (2T).
ii) Si el portaobjetos se ha preparado según el punto 5.1.ii):
Preparar la dilución de trabajo (DT) del anticuerpo en el tampón IF. La dilución de trabajo afecta a la especificidad.
Figura 1. Preparación del portaobjetos con arreglo a los puntos 5.1.i) y 5.3.i)
Figura 2. Preparación del portaobjetos con arreglo a los puntos 5.1.ii) y 5.3.ii)
5.3.1 Colocar los portaobjetos en un pañuelo de papel humedecido. Cubrir cada pocillo completamente con la dilución o diluciones de anticuerpos. El volumen de anticuerpos aplicado en cada pocillo debe ser como mínimo equivalente al volumen de extracto aplicado.
En caso de que no existan instrucciones específicas de los suministradores de los anticuerpos deberá aplicarse el siguiente procedimiento:
5.3.2 Dejar en incubación los portaobjetos en papel húmedo durante 30 minutos a temperatura ambiente (18-25°C).
5.3.3 Sacudir las gotitas de cada portaobjetos y enjuagar cuidadosamente con tampón IF. Lavar por inmersión durante cinco minutos en tampón IF-Tween (apéndice 4) y posteriormente en tampón IF. Evitar la transferencia de aerosoles o gotitas que pudiera provocar contaminaciones cruzadas. Eliminar cuidadosamente el exceso de humedad secándolo suavemente.
5.3.4 Colocar los portaobjetos en papel húmedo. Cubrir los pocillos con la dilución del conjugado FITC utilizado para determinar el título. El volumen de conjugado aplicado en los pocillos debe ser idéntico al volumen de anticuerpos aplicado.
5.3.5 Dejar en incubación los portaobjetos en papel húmedo durante 30 minutos a temperatura ambiente (18-25°C).
5.3.6 Sacudir las gotitas de conjugado del portaobjetos. Enjuagar y lavar como antes (5.3.3).
Eliminar cuidadosamente el exceso de humedad.
5.3.7 Echar con una pipeta 5 a 10 µl de tampón fosfato glicerol de 0,1 M (apéndice 4) o un volumen de solución comercial que proteja la fluorescencia (antifading) en cada pocillo y colocar un cubreobjetos.
5.4 Lectura de la prueba IF
5.4.1 Examinar los portaobjetos en un microscopio epifluorescente con filtros adecuados para que se produzca la excitación del FITC, con aceite o agua de inmersión y a 500-1 000 aumentos. Recorrer los pocillos a lo largo de dos diámetros perpendiculares entre sí y alrededor del perímetro. En el caso de muestras que presenten un bajo número de células o ninguna, deben observarse como mínimo 40 campos microscópicos.
En primer lugar, comprobar el control positivo. Las células deben ser fluorescentes brillantes y estar completamente teñidas en el título de anticuerpos o la dilución de trabajo determinados. La prueba IF (sección VI.A.5) debe repetirse si la tinción no es correcta.
5.4.2 Comprobar si hay células fluorescentes brillantes con morfología característica de R. solanacearum en los pocillos de los portaobjetos (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). La intensidad de la fluorescencia debe ser equivalente a la de la cepa de control positivo en la misma dilución de anticuerpos. Deberán descartarse las células que presenten una tinción incompleta o cuya fluorescencia sea escasa.
Deberá repetirse la prueba si se sospecha que se ha producido cualquier posible contaminación. Este puede ser el caso cuando todos los portaobjetos de un lote muestren células positivas debido a la contaminación del tampón o si se encuentran células positivas (fuera de los pocillos de los portaobjetos) en la superficie.
5.4.3 Existen varios problemas inherentes a las características específicas de la prueba de inmunofluorescencia. En los precipitados de cuñas basales de patata y los precipitados de segmentos del tallo pueden aparecer poblaciones de base de células fluorescentes de morfología atípica y bacterias saprofitas con reacción cruzada cuyo tamaño y morfología sean similares a los de R. solanacearum.
5.4.4 Tener solamente en cuenta las células fluorescentes con tamaño y morfología típicos en el título o la dilución de trabajo de los anticuerpos, tal como se describe en 5.3.
5.4.5 Interpretación de la lectura de la prueba IF:
i) si se encuentran células fluorescentes brillantes con morfología característica, estimar el número medio de células típicas por campo microscópico y calcular el número de células típicas por ml de precipitado resuspendido (apéndice 5).
La lectura IF es positiva en las muestras con un mínimo de 5 × 103 células típicas por ml de precipitado resuspendido. Se considera entonces que la muestra puede estar contaminada y deben efectuarse otras pruebas,
ii) la lectura IF es negativa en las muestras con menos de 5 × 103 células por ml de precipitado resuspendido, y se considera negativa la muestra. No es preciso efectuar más pruebas.
6. Prueba de reacción en cadena de la polimerasa (prueba PCR)
Principios
Cuando se utilice la prueba PCR como principal prueba de selección y dé resultados positivos, deberá efectuarse la prueba de aislamiento o la IF como segunda prueba obligatoria de selección. Cuando se utilice la PCR como segunda prueba de selección y dé resultados positivos, deberán efectuarse las pruebas establecidas en el diagrama de flujo para completar el diagnóstico.
La aplicación de este método como principal método de selección sólo se recomienda en el caso de que se hayan adquirido conocimientos especializados del mismo.
Nota: Las pruebas preliminares realizadas con este método deberían permitir la detección reproducible de 103 a 104 células de R. solanacearum por ml añadidas a los extractos de muestras que previamente proporcionaron resultados negativos. Puede ser necesario llevar a cabo experimentos de optimización para lograr niveles máximos de sensibilidad y especificidad en todos los laboratorios.
Utilizar reactivos y protocolos PCR validados (véase el apéndice 6). Seleccionar preferiblemente un método con control interno.
Tomar las precauciones adecuadas para evitar la contaminación de la muestra con el ADN buscado. La prueba PCR debe ser efectuada por técnicos experimentados, en laboratorios especializados en biología molecular, con el fin de reducir al máximo la posibilidad de contaminación con el ADN buscado.
Como muestras finales del procedimiento siempre deben efectuarse controles negativos (para la extracción de ADN y los procedimientos PCR) que dejen constancia de si se ha producido arrastre de ADN.
En la prueba PCR deben incluirse los siguientes controles negativos:
– extracto de la muestra que previamente haya proporcionado resultados negativos para R. solanacearum,
– controles de los tampones utilizados para extraer la bacteria y el ADN de la muestra,
– mezcla para la reacción PCR.
Deben incluirse los siguientes controles positivos:
– alícuotas de precipitados resuspendidos a los que se ha añadido R. solanacearum (para la preparación véase el apéndice 3, punto B),
– una suspensión de 106 células por ml de R. solanacearum en agua de un aislado virulento (por ejemplo, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; véase el apéndice 3, punto B),
– siempre que sea posible, utilizar asimismo ADN extraído de las muestras de control positivas en la prueba PCR.
Para evitar toda posible contaminación, preparar los controles positivos en un entorno distinto al de las muestras que vayan a analizarse.
Los extractos de muestras deben contener la cantidad mínima de tierra posible. En determinados casos puede ser recomendable preparar los extractos a partir de patatas lavadas cuando vayan a utilizarse protocolos PCR.
En el apéndice 3 se enumeran los materiales normalizados de control positivo y negativo que pueden utilizarse en esta prueba.
6.1 Métodos de purificación del ADN
Utilizar muestras de control positivas y negativas como se indica más arriba (véase el apéndice 3).
Procesar el material de control de la misma manera que la muestra o muestras.
Existen diferentes métodos para purificar el ADN buscado a partir de sustratos de muestras complejas, separando de esta manera los inhibidores de PCR y otras reacciones enzimáticas y concentrando el ADN buscado en el extracto de la muestra. Se ha optimizado el método siguiente para su utilización con los métodos PCR validados mostrados en el apéndice 6.
a) Método de Pastrik (2000)
1) verter con una pipeta 220 µl de tampón de lisis [100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)] en un tubo eppendorf de 1,5 ml;
2) añadir 100 µl de extracto de muestra y colocar en un calentador o al baño maría a 95°C durante diez minutos;
3) colocar el tubo en hielo durante cinco minutos;
4) añadir 80 µl de solución estándar de lisozima (50 mg de lisozima por ml en 10 mM Tris HCl, pH 8,0) e incubar a 37°C durante 30 minutos;
5) añadir 220 µl de solución A Easy DNA® (Invitrogen), mezclar adecuadamente por agitación e incubar a 65°C durante 30 minutos;
6) añadir 100 µl de solución B Easy DNA® (Invitrogen) y agitar vigorosamente hasta que el precipitado se mueva libremente en el tubo y la muestra sea uniformemente viscosa;
7) añadir 500 µl de cloroformo y agitar hasta que disminuya la viscosidad y la mezcla sea homogénea;
8) centrifugar a 15.000 g durante 20 minutos a 4°C para separar las fases y formar la interfase;
9) transferir la fase superior a un tubo Eppendorf sin utilizar;
10) añadir 1 ml de etanol al 100% (– 20°C), agitar brevemente e incubar en hielo durante diez minutos;
11) centrifugar a 15.000 g durante 20 minutos a 4°C y retirar el etanol del precipitado;
12) añadir 500 µl de etanol al 80% (– 20°C) y mezclar invirtiendo el tubo;
13) centrifugar a 15.000 g durante diez minutos a 4°C, guardar el precipitado y retirar el etanol;
14) dejar que el precipitado se seque al aire o en un Speed Vac de ADN;
15) resuspender el precipitado en 100 µl de agua ultrapura estéril y dejar a temperatura ambiente durante un mínimo de 20 minutos;
16) almacenar a –20°C hasta que se necesite para la prueba PCR;
17) centrifugar todo precipitado blanco y utilizar 5 µl del sobrenadante que contenga ADN para la prueba PCR.
b) Otros métodos
Pueden aplicarse otros métodos de extracción del ADN, como por ejemplo Qiagen DNeasy Plant Kit, siempre que se haya demostrado que son igual de eficaces en la purificación del ADN a partir de muestras de control que contengan de 103 a 104 células patógenas por ml.
6.2 PCR
6.2.1 Preparar plantillas de ensayo y de control para la prueba PCR con arreglo a los protocolos validados (sección VI.A.6). Preparar una dilución decimal de extracto de ADN de la muestra (1:10 en agua ultrapura).
6.2.2 Preparar la mezcla de reacción PCR apropiada en un entorno sin contaminación de acuerdo con los protocolos publicados (apéndice 6). Cuando sea posible, se recomienda utilizar un protocolo PCR multiplex que incorpore asimismo un control interno de la prueba PCR.
6.2.3 Añadir de 2 a 5 µl de extracto de ADN por 25 µl de reacción PCR en tubos PCR estériles con arreglo a los protocolos PCR (véase el apéndice 6).
6.2.4 Incorporar una muestra de control negativo que contenga sólo mezcla de reacción PCR y añadir la misma fuente de agua ultrapura utilizada en la mezcla PCR en lugar de la muestra.
6.2.5 Colocar los tubos en el mismo termociclador utilizado en las pruebas preliminares y aplicar el programa PCR optimizado adecuado (apéndice 6).
6.3 Análisis del producto de la PCR
6.3.1 Resolver los amplicones PCR mediante electroforesis en gel de agarosa. Aplicar como mínimo 12 µl de mezcla de reacción de ADN amplificada de cada muestra mezclada con 3 µl de tampón de carga (apéndice 6) en 2,0% (w/v) de geles de agarosa en un tampón de tris-acetatoEDTA (TAE) (apéndice 6) a 5-8 V por cm. Utilizar un marcador de ADN adecuado, por ejemplo, 100 pb ladder.
6.3.2 Revelar las bandas de ADN tiñéndolas con bromuro de etidio (0,5 mg/l) durante 30 a 60 minutos, tomando las precauciones adecuadas para el manejo de este mutágeno.
6.3.3 Observar el gel teñido mediante transiluminación en UV de onda corta (λ = 302 nm) para productos de la PCR amplificados del tamaño esperado (apéndice 6) y anotar los resultados.
6.3.4 En relación con todos los nuevos descubrimientos o casos, para verificar la autenticidad del amplicón PCR efectuar un análisis de la enzima de restricción en una muestra del ADN restante amplificado incubando a la temperatura óptima y durante el tiempo necesario con una enzima y un tampón apropiados (véase el apéndice 6). Resolver los fragmentos digeridos mediante electroforesis en gel de agarosa, al igual que antes, y observar el patrón característico del fragmento de restricción con transiluminación UV una vez teñido con bromuro de etidio y comparar con el control positivo no digerido y digerido.
Interpretación de los resultados de la prueba PCR
La prueba PCR es negativa si el amplicón PCR específico de R. solanacearum del tamaño esperado no se detecta en la muestra en cuestión pero sí se detecta en todas las muestras de controles positivos (en caso de PCR multiplex con cebadores de control interno específicos de la planta, se debe amplificar con la muestra en cuestión un segundo producto PCR del tamaño esperado).
La prueba PCR es positiva si se detecta el amplicón PCR específico de R. solanacearum del tamaño y patrón de restricción esperado (cuando se exija), siempre que no se amplifique a partir de ninguna de las muestras de control negativo. La confirmación fiable de un resultado positivo puede obtenerse también repitiendo la prueba con un segundo conjunto de cebadores de la PCR (apéndice 6).
Nota: Puede sospecharse la inhibición de la PCR si el amplicón esperado se obtiene a partir de la muestra de control positivo que contiene R. solanacearum en agua, pero se obtienen resultados negativos de los controles positivos con R. solanacearum en extracto de patata. En protocolos PCR multiplex con controles PCR internos, la inhibición de la reacción se indica cuando no se obtiene ninguno de los dos amplicones.
Puede sospecharse la existencia de contaminación si el amplicón esperado se obtiene a partir de uno o varios de los controles negativos.
7. Prueba de hibridación fluorescente in situ (prueba FISH)
Principio
Cuando se utilice la prueba FISH como primera prueba de selección y esta proporcione resultados positivos, deberá efectuarse la prueba de aislamiento o la prueba IF como segunda prueba obligatoria de selección. Cuando se utilice la prueba FISH como segunda prueba de selección y dé resultados positivos, deberán efectuarse las pruebas establecidas en el diagrama de flujo para completar el diagnóstico.
Nota: Utilizar oligosondas específicas para R. solanacearum validadas (véase el apéndice 7). Las pruebas preliminares realizadas con este método deberían permitir la detección reproducible de al menos 103 a 104 células de R. solanacearum por ml añadidas a los extractos de muestras que hayan dado anteriormente resultados negativos.
El procedimiento siguiente debería efectuarse, a ser posible, con extracto de muestra recién preparado, pero también puede realizarse con éxito con extracto de muestra que se haya almacenado en glicerol a una temperatura comprendida entre –16 y –24°C o entre –68 y –86°C.
Utilizar como controles negativos alícuotas de extracto de muestras que hayan dado previamente resultados negativos para R. solanacearum.
Como controles positivos, preparar suspensiones que contengan de 105 a 106 células por ml de R. solanacearum biovar 2 (por ejemplo la cepa NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; véase el apéndice 3) en tampón de fosfato de 0,01 M de un cultivo de tres a cinco días. Preparar en otro portaobjetos controles positivos de la cepa homóloga o de cualquier otra cepa de referencia de R. solanacearum, suspendida en extracto de patata, tal como se especifica en el apéndice 3, punto B.
El uso de una oligosonda eubacteriana con etiqueta FITC ofrece un control para el proceso de hibridación, ya que teñirá todas las eubacterias presentes en la muestra.
En el apéndice 3, punto A, se enumeran los materiales normalizados de control positivo y negativo que pueden utilizarse en esta prueba.
Procesar el material de control de la misma manera que la muestra o muestras.
7.1 Fijación del extracto de patata
El protocolo siguiente se basa en Wullings et al. (1998).
7.1.1 Preparar la solución de fijación (véase el apéndice 7).
7.1.2 Verter 100 µl de cada extracto de muestra en un tubo eppendorf y centrifugar durante siete minutos a 7 000 g.
7.1.3 Separar el sobrenadante y disolver el precipitado en 200 µl de solución fijadora preparada con menos de 24 horas de antelación. Agitar e incubar durante una hora en el refrigerador.
7.1.4 Centrifugar durante siete minutos a 7 000 g, separar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 75 µl de tampón de fosfato de concentración 0,01 M (véase el apéndice 7).
7.1.5 Colocar 16 µl de las suspensiones fijadas en un portaobjetos múltiple limpio, tal como muestra la figura 7.1. Aplicar dos muestras diferentes por portaobjetos sin diluir y utilizar 10 µl para realizar una dilución a 1:100 (en tampón de fosfato de concentración 0,01 M). La solución de la muestra restante (49 µl) puede almacenarse a –20°C tras la adición de 1 volumen de etanol al 96 %. En caso de que sea necesario repetir la prueba FISH, separar el etanol mediante centrifugación y añadir un volumen equivalente de tampón de fosfato de concentración 0,01 M (mezclar mediante agitación).
Figura 7.1. Distribución del portaobjetos para la prueba FISH.
7.1.6 Secar los portaobjetos al aire (o con secador de portaobjetos a 37°C) y fijarlos flameándolos.
El procedimiento puede interrumpirse en esta fase, pudiéndose proseguir con la hibridación al día siguiente. Los portaobjetos deben almacenarse secos y sin polvo a temperatura ambiente.
7.2 Hibridación
7.2.1 Deshidratar las células en series de etanol escalonadas al 50%, 80% y 96% durante un minuto cada una. Secar las preparaciones en un portaobjetos.
7.2.2 Preparar una cámara de incubación húmeda recubriendo el fondo de una caja hermética con papel de seda o de filtro empapado en 1x hybmix (apéndice 7). Preincubar la caja en el horno de hibridación a 45°C durante un mínimo de diez minutos.
7.2.3 Aplicar 10 µl de solución de hibridación (apéndice 7) a ocho pocillos (pocillos 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 y 10; véase la figura 7.1) de cada portaobjetos dejando vacíos los dos pocillos centrales (3 y 8).
7.2.4 Aplicar cubreobjetos (24 × 24 mm) al primer y a los cuatro últimos pocillos evitando la entrada de aire. Colocar los portaobjetos en la cámara húmeda precalentada y dejar que se produzca la hibridación durante cinco horas a 45°C en la oscuridad.
7.2.5 Preparar tres vasos de precipitado que contengan 1 l de agua Milli Q (grado molecular), 1 l de 1x hybmix (334 ml 3x hybmix y 666 ml agua Milli Q) y 1 l de 1/8x hybmix (42 ml 3x hybmix y 958 ml agua Milli Q). Preincubarlos al baño maría a 45°C.
7.2.6 Quitar los cubreobjetos de las preparaciones y colocar estas en un portaobjetos.
7.2.7 Lavar el exceso de sonda mediante incubación durante 15 minutos en el vaso de precipitado con 1x hybmix a 45°C.
7.2.8 Transferir el portaobjetos a una solución de lavado de hybmix a 1/8 e incubar durante otros 15 minutos.
7.2.9 Sumergir las preparaciones brevemente en agua Milli Q y colocarlas en papel de filtro. Eliminar el exceso de humedad cubriendo la superficie con cuidado con papel de filtro. Verter de 5 a 10 µl de solución de montaje protectora de la fluorescencia (por ejemplo Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA, o equivalente) en cada pocillo y aplicar un cubreobjetos grande (24 × 60 mm) sobre la totalidad de la preparación.
7.3 Lectura de la prueba FISH
7.3.1 Los portaobjetos deben examinarse inmediatamente utilizando un microscopio epifluorescente a 630 o 1.000 aumentos con aceite de inmersión. Con un filtro adecuado para isotiocianato de fluoresceína (FITC), las células eubacterianas (incluida la mayoría de las células gramnegativas) de la muestra aparecen teñidas de verde fluorescente. Utilizando un filtro para tetrametilrodamina-5-isotiocianato, las células de R. solanacearum marcadas con Cy3 aparecen teñidas de rojo fluorescente. Comparar la morfología de las células con la de los controles positivos. Las células deben ser fluorescentes brillantes y estar completamente teñidas. La prueba FISH (sección VI.A.7) debe repetirse si la tinción es aberrante. Recorrer los pocillos a lo largo de dos diámetros perpendiculares entre sí y alrededor del perímetro. En el caso de muestras que presenten un bajo número de células o ninguna, deben observarse como mínimo 40 campos microscópicos.
7.3.2 Comprobar si hay células fluorescentes brillantes con la morfología característica de R. solanacearum en los pocillos de los portaobjetos (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). La intensidad de la fluorescencia debe ser equivalente o mejor que la de la cepa de control positivo. Deberán descartarse las células que presenten una tinción incompleta o cuya fluorescencia sea escasa.
7.3.3 Deberá repetirse la prueba si se sospecha que se ha producido cualquier posible contaminación. Este puede ser el caso cuando todos los portaobjetos de un lote muestren células positivas debido a la contaminación del tampón o si se encuentran células positivas (fuera de los pocillos de los portaobjetos) en la superficie.
7.3.4 Existen varios problemas inherentes a la especificidad de la prueba FISH. En los precipitados de cuñas basales de patata y de segmentos del tallo pueden aparecer poblaciones de base de células fluorescentes de morfología atípica y bacterias saprofitas con reacción cruzada cuyo tamaño y morfología sean similares a los de R. solanacearum, aunque con mucha menor frecuencia que en la prueba IF.
7.3.5 Ténganse en cuenta únicamente las células fluorescentes de tamaño y morfología típicos.
7.3.6 Interpretación de los resultados de la prueba FISH.
i) Se obtendrán resultados válidos en la prueba FISH siempre que en todos los controles positivos y en ninguno de los controles negativos se observen células teñidas de verde fluorescente brillante, cuyo tamaño y morfología sean los típicos de las de R. solanacearum, cuando se utilice el filtro FITC, y células teñidas de rojo fluorescente brillante cuando se utilice el filtro de rodamina. Si se encuentran células fluorescentes brillantes con morfología característica, estimar el número medio de células típicas por campo microscópico y calcular el número de células típicas por ml de precipitado resuspendido (apéndice 4). Las muestras que presenten al menos 5 × 103 células típicas por ml de precipitado resuspendido se consideran potencialmente contaminadas. Es preciso efectuar nuevas pruebas. Las muestras que presenten menos de 5 × 103 células típicas por ml de precipitado resuspendido se consideran negativas.
ii) Los resultados de la prueba FISH serán negativos cuando no se observen células teñidas de rojo fluorescente brillante con un tamaño y morfología típicos de R. solanacearum utilizando el filtro de rodamina, siempre que se observen células teñidas de rojo fluorescente brillante típicas en las preparaciones de control positivo cuando se utilice el filtro de rodamina.
8. Pruebas de ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA)
Principio
Las pruebas ELISA solamente pueden utilizarse como prueba opcional además de las pruebas IF, PCR o FISH, debido a la sensibilidad relativamente baja de esta prueba. Cuando se utilice ELISA-DASI, es obligatorio efectuar un enriquecimiento y utilizar anticuerpos monoclonales (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Puede resultar de utilidad efectuar un enriquecimiento de las muestras antes de utilizar la prueba ELISA, a fin de incrementar la sensibilidad de la prueba, pero puede fracasar debido a la competencia de otros organismos en la muestra.
Nota: Utilizar una fuente validada de anticuerpos de R. solanacearum (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/ Public/irc/sanco/Home/main). Se recomienda determinar el título para cada nuevo lote de anticuerpos. El título se define como la dilución más elevada en la que se produce una re-acción óptima cuando se analiza una suspensión que contenga de 105 a 106 células por ml de la cepa homóloga de R. solanacearum, utilizando conjugados de anticuerpos secundarios apropiados, según las recomendaciones del fabricante. Durante el análisis, deben utilizarse los anticuerpos en diluciones de trabajo cercanas o equivalentes a la formulación comercial.
Determinar el título de los anticuerpos en una suspensión de 105 a 106 células por ml de la cepa homóloga de R. solanacearum.
Incluir una muestra de extracto que haya dado previamente resultados negativos para R. solanacearum y una suspensión de una bacteria que no tenga reacción cruzada en tampón fosfato salino (PBS) como controles negativos.
Como control positivo utilizar alícuotas de extracto de muestra que haya dado previamente resultados negativos, mezcladas con 103 a 104 células por ml de R. solanacearum biovar 2 (por ejemplo, cepa NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; véase el apéndice 3, puntos A y B). Para la comparación de los resultados de cada placa utilizar una suspensión normalizada de 105 a 106 células por ml en PBS de R. solanacearum. Debe asegurarse que los controles positivos estén bien separados en la placa de microtitulación de la muestra o las muestras analizadas.
En el apéndice 3, punto A, se enumeran los materiales normalizados de control positivo y negativo que pueden utilizarse en esta prueba.
Procesar el material de control de la misma manera que la muestra o muestras.
Se han validado dos protocolos ELISA:
a) ELISA indirecto (Robinson Smith et al., 1995):
1) utilizar de 100 a 200 µl de alícuotas de extracto de muestra. (Si se calienta a 100°C durante cuatro minutos al baño maría o un calentador pueden reducirse en algunos casos los resultados no específicos.);
2) añadir un volumen igual de tampón de tapizado de doble concentración (apéndice 4) y agitar;
3) aplicar 100 µl de alícuotas en al menos dos pocillos de una placa de microtitulación (por ejemplo, Nunc-Polysorp o equivalente) e incubar durante una hora a 37°C o durante una noche a 4°C;
4) quitar los extractos de los pocillos. Lavar estos tres veces con PBS-Tween (apéndice 4), dejando en ellos la última solución de lavado durante al menos cinco minutos;
5) preparar la dilución adecuada de anticuerpos contra R. solanacearum en tampón de bloqueo (apéndice 4). Para anticuerpos comerciales validados, utilizar las diluciones recomendadas (normalmente una concentración que duplique el título);
6) añadir 100 µl a cada pocillo e incubar durante una hora a 37°C;
7) quitar la solución de anticuerpos de los pocillos y lavar como se describe en el punto 4;
8) preparar la dilución adecuada de conjugado de fosfatasa alcalina de anticuerpos secundarios en tampón de bloqueo. Añadir 100 µl a cada pocillo e incubar durante una hora a 37°C;
9) quitar los anticuerpos conjugados de los pocillos y lavar como se describe en el punto 4;
10) añadir 100 µl de solución de sustrato de fosfatasa alcalina (apéndice 4) a cada pocillo. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente y leer la absorbencia a 405 nm a intervalos regulares durante 90 minutos.
b) ELISA-DASI (doble sandwich de anticuerpos indirecto):
1) preparar la dilución adecuada de inmunoglobulinas policlonales contra R. solanacearum en tampón de bloqueo de pH 9,6 (apéndice 4). Añadir 200 µl a cada pocillo. Incubar a 37°C de cuatro a cinco horas o a 4°C durante 16 horas;
2) lavar tres veces los pocillos con PBS-Tween (apéndice 4).
Añadir 190 µl de extracto de muestra en al menos dos pocillos. Añadir asimismo controles positivos y negativos en dos pocillos de cada placa. Incubar durante 16 horas a 4°C;
3) lavar tres veces los pocillos con PBS-Tween (apéndice 4);
4) preparar una dilución apropiada de anticuerpos monoclonales específicos de R. solanacearum en PBS (apéndice 4) que contenga asimismo 0,5% de seroalbúmina bovina (BSA) y añadir 190 µl a cada pocillo. Incubar a 37°C durante dos horas;
5) lavar tres veces los pocillos con PBS-Tween (apéndice 4);
6) preparar una dilución apropiada de inmunoglobulinas anti-ratón conjugadas con fosfatasa alcalina en PBS. Añadir 190 µl a cada pocillo. Incubar a 37°C durante dos horas;
7) lavar tres veces los pocillos con PBS-Tween (apéndice 4);
8) preparar una solución de sustrato de fosfatasa alcalina que contenga 1 mg de p-nitrofenil fosfato por ml de tampón de substrato (apéndice 4). Añadir 200 µl a cada pocillo. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente y leer la absorbencia a 405 nm a intervalos regulares durante 90 minutos.
Interpretación de los resultados de la prueba ELISA
La prueba ELISA es negativa si la lectura media de la densidad óptica (DO) de los pocillos de cada muestra duplicada es < 2 veces la DO del pocillo de control del extracto de muestra negativa, siempre y cuando todas las DO de los controles positivos sean superiores a 1,0 (tras 90 minutos de incubación con el substrato) y sean más de dos veces superiores a la DO obtenida a partir de extractos de muestra negativa.
La prueba ELISA es positiva si las lecturas medias de la DO de los pocillos de cada muestra duplicada es > 2 veces la DO en el pocillo del extracto de muestra negativa, siempre y cuando las lecturas de DO en todos los pocillos de control negativo sean < 2 veces las de los pocillos de control positivo.
Las lecturas ELISA negativas en pocillos de control positivo indican que no se ha efectuado correctamente la prueba o que ha estado inhibida. Las lecturas ELISA positivas en pocillos de control negativo indican que se ha producido contaminación cruzada o unión de anticuerpos no específicos.
9. Prueba de bioensayo
Nota: Las pruebas preliminares realizadas con este método deberían permitir la detección reproducible de 103 a 104 unidades formadoras de colonias de R. solanacearum por ml añadidas a los extractos de muestras que previamente proporcionaron resultados negativos (para la preparación véase el apéndice 3).
Se puede alcanzar la máxima sensibilidad de detección cuando se utilicen extractos de muestras que se acaben de preparar y cuando las condiciones de cultivo sean las óptimas. No obstante, este método puede aplicarse también con éxito a extractos que se hayan almacenado en glicerol a una temperatura comprendida entre –68 y –86°C.
El protocolo siguiente se basa en Janse (1988):
9.1 Utilizar diez plantas de prueba de un cultivar de tomate sensible (por ejemplo, Moneymaker o cultivar con sensibilidad equivalente determinado por el laboratorio de análisis) en la fase de la tercera hoja verdadera para cada muestra. Para más detalles de cultivo, véase el apéndice 8. Otra alternativa es utilizar berenjenas (por ejemplo, cultivar Black Beauty o cultivares con sensibilidad equivalente), únicamente plantas en fase de hoja 23 hasta la plena expansión de la tercera hoja verdadera. Se ha observado que los síntomas son menos graves y que se desarrollan más lentamente en la berenjena. Por tanto, cuando sea posible se recomienda utilizar plántulas de tomate.
9.2 Distribuir 100 µl de extracto de muestra entre las plantas analizadas.
9.2.1 Inoculación con jeringa.
Inocular los tallos de las patatas justo por encima de los cotiledones con una jeringa provista de una aguja hipodérmica (no menos de 23G). Distribuir la muestra entre las plantas analizadas.
9.2.2 Inoculación en estrías.
Sosteniendo la planta entre dos dedos, aplíquese con una pipeta una gota (de unos 5-10 µl) del precipitado en suspensión en el tallo situado entre los cotiledones y la primera hoja.
Con un bisturí estéril practicar una incisión diagonal de aproximadamente 1,0 cm de largo y una profundidad de aproximadamente 2/3 del grosor del tallo, comenzando el corte a partir de la gota del precipitado.
Sellar el corte con vaselina estéril utilizando una jeringa.
9.3 Inocular con la misma técnica cinco plantones con una suspensión acuosa de 105 a 106 células por ml preparada a partir de un cultivo de 48 horas de una cepa biovar 2 virulenta de R. solanacearum como control positivo y con tampón de precipitado (apéndice 4) como control negativo. Separar las plantas de control positivo y negativo de las otras para evitar la contaminación cruzada.
9.4 Cultivar las plantas de prueba en instalaciones de cuarentena hasta un máximo de cuatro semanas entre 25 y 30°C con elevada humedad relativa, regándolas adecuadamente para evitar que se aneguen o se marchiten por deficiencia hídrica. Para evitar la contaminación se deben incubar las plantas de control positivo y negativo en bancos claramente separados en un invernadero o cámara de cultivo; en el caso de que se disponga de un espacio reducido, garantizar la estricta separación entre tratamientos. En el caso de que deban incubarse juntas plantas para distintas muestras, deben separarse con las pantallas adecuadas. Durante la fertilización, el riego, la inspección y cualquier otra manipulación deben extremarse las precauciones para evitar la contaminación cruzada. Es esencial mantener los invernaderos y las cámaras libres de toda plaga de insectos, ya que estos pueden transmitir la bacteria de una muestra a otra.
Comprobar si se aprecian síntomas de marchitamiento, epinastia, clorosis y/o crecimiento reducido.
9.5 Aislarlas de las plantas infectadas (sección II.3) e identificar cultivos purificados de presunta R. solanacearum (sección VI. B).
9.6 Si no se observan síntomas después de tres semanas, efectuar una prueba IF/PCR/Aislamiento en una muestra mixta de secciones de 1 cm del tallo de cada planta analizada, tomadas por encima del punto de inoculación. Si la prueba es positiva, efectuar una dilución en placas (sección 4.1).
9.7 Identificar cualquier cultivo purificado de presunta R. solanacearum (sección VI. B).
Interpretación de los resultados de la prueba del bioensayo
Se obtienen resultados válidos de la prueba del bioensayo cuando las plantas del control positivo muestran síntomas típicos, pueden reaislarse las bacterias de estas plantas y no se encuentran síntomas en los controles negativos.
La prueba del bioensayo es negativa si las plantas analizadas no están infectadas por R. solanacearum, siempre que se detecte R. solanacearum en los controles positivos.
La prueba del bioensayo es positiva si las plantas analizadas están infectadas por R. solanacearum.
B. PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN
Identificar cultivos puros de aislados de presunta R. solanacearum utilizando al menos dos de las pruebas siguientes basadas en principios biológicos diferentes.
Cuando proceda, incluir cepas de referencia conocidas para cada prueba efectuada (véase el apéndice 3).
1. Pruebas de identificación nutricional y enzimática
Determinar las propiedades fenotípicas siguientes que estén universalmente presentes o ausentes en R. solanacearum, de acuerdo con los métodos de Lelliott y Stead (1987), Klement et al. (1990) y Schaad (2001).
Pruebas ·
Resultado esperado ·
Producción de pigmento fluorescente ·
– ·
Inclusiones de poli-β-hidroxibutirato ·
+ ·
Prueba de la oxidación/fermentación ·
O+/F– ·
(O/F) ·
·
Actividad catalasa ·
+ ·
Prueba de oxidasa de Kovac ·
+ ·
Reducción de nitratos ·
+ ·
Utilización de citratos ·
+ ·
Crecimiento a 40°C ·
– ·
Crecimiento en NaCl al 1% ·
+ ·
Crecimiento en NaCl al 2% ·
– ·
Actividad de dihidrolasa de arginina ·
– ·
Licuefacción de la gelatina ·
– ·
Hidrólisis del almidón ·
– ·
Hidrólisis de la esculina ·
– ·
Producción de levano ·
– ·
2. Prueba IF
2.1 Preparar una suspensión de aproximadamente 106 células por ml en tampón IF (apéndice 4).
2.2 Preparar una serie de diluciones a 1/2 de un antisuero adecuado (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
2.3 Aplicar el procedimiento IF (sección VI.A.5).
2.4 La prueba IF será positiva si el título IF del cultivo es equivalente al del control positivo.
3. Prueba ELISA
Nota: Si solamente se efectúan dos pruebas de identificación, no debe utilizarse ninguna otra prueba serológica además de este método.
3.1 Preparar una suspensión de aproximadamente 108 células por ml en 1X PBS (apéndice 4).
3.2 Llevar a cabo un procedimiento ELISA adecuado con un anticuerpo monoclonal específico de R. solanacearum.
3.3 La prueba ELISA será positiva si la lectura ELISA obtenida del cultivo es como mínimo la mitad de la obtenida para el control positivo.
4. Prueba PCR
4.1 Preparar una suspensión de aproximadamente 106 células por ml en agua estéril de grado molecular.
4.2 Calentar 100 µl de la suspensión celular en tubos cerrados en un calentador o al baño maría a 100°C durante cuatro minutos. Las muestras pueden almacenarse entonces a una temperatura de –16 a –24°C hasta que sea necesario.
4.3 Aplicar los procedimientos PCR adecuados para amplificar los amplicones específicos de R. solanacearum [por ejemplo, Seal et al. (1993); Pastrik y Maiss (2000); Pastrik et al. (2002); Boudazin et al. (1999); Opina et al. (1997); Weller et al. (1999)].
4.4 Se logrará la identificación positiva de R. solanacearum si los amplicones de la PCR son del mismo tamaño y tienen los mismos polimorfismos de la longitud del fragmento de restricción que los de la cepa de control positivo.
5. Prueba FISH
5.1 Preparar una suspensión de aproximadamente 106 células por ml en agua ultrapura.
5.2 Aplicar el procedimiento FISH (sección VI.A.7) con al menos dos oligosondas específicas para R. solanacearum(apéndice 7).
5.3 La prueba FISH será positiva si se obtienen las mismas reacciones del cultivo y el control positivo.
6. Perfiles de ácidos grasos (Fatty acid profiling o FAP)
6.1 Mantener el cultivo en agar de tripticasa de soja (Oxoide) durante 48 horas a 28°C.
6.2 Aplicar un procedimiento FAP adecuado (Janse, 1991; Stead, 1992).
6.3 La prueba FAP será positiva si el perfil del presunto cultivo es idéntico al del control positivo. Los ácidos grasos cuya presencia es característica son 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH y 18:1 2OH, y la ausencia de 16:0 3OH es altamente indicativa de Ralstonia sp.
7. Métodos de caracterización de las cepas
Se recomienda efectuar la caracterización de las cepas con uno de los métodos siguientes para cada nuevo caso de aislamiento de R. solanacearum.
Cuando proceda, incluir cepas de referencia conocidas para cada prueba efectuada (véase el apéndice 3).
7.1 Determinación de los biovares
R. solanacearum se separa en biovares en función de la capacidad para utilizar y/o oxidar tres disacáridos y tres hexosas alcohólicas (Hayward, 1964 y Hayward et al., 1990). Los medios nutritivos para la prueba del biovar se describen en el apéndice 2. Esta prueba puede efectuarse con éxito inoculando los medios por perforación con cultivos puros de aislados de R. solanacearum e incubando a 28°C. Si los medios se distribuyen en placas estériles de cultivo de células de 96 pocillos (200 µl por pocillo) puede observarse en un plazo de 72 horas un cambio de color, del verde oliva al amarillo, lo que indica un resultado positivo de la prueba.
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Biovar ·
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1 ·
2 ·
3 ·
4 ·
5 ·
Utilización de: ·
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Maltosa ·
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+ ·
+ ·
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Lactosa ·
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D (+) Celobiosa ·
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Manitol ·
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Sorbitol ·
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Dulcitol ·
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+ ·
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- ·
El biovar 2 se diferencia en subfenotipos mediante pruebas adicionales
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Biovar 2A (distribución mundial) ·
Biovar 2A (en Chile y Colombia) ·
Biovar 2T (en áreas tropicales) ·
Utilización de trehalosa ·
- ·
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+ ·
Utilización de meso-inositol ·
+ ·
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+ ·
Utilización de D (-) ribosa ·
- ·
- ·
+ ·
Actividad pectolítica ·
baja ·
baja ·
alta ·
(1) Véase Lelliott y Stead (1987).
7.2 Obtención de la huella dactilar genómica
La diferenciación molecular de las cepas en el complejo de R. solanacearum puede conseguirse mediante diferentes técnicas, entre las que se incluyen:
7.2.1 Análisis de los polimorfismos de la longitud del fragmento de restricción (RFLP) (Cook et al., 1989).
7.2.2 PCR de secuencia repetitiva utilizando cebadores REP, BOX y ERIC (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995).
7.2.3 Análisis de los polimorfismos de la longitud del fragmento amplificado (AFLP) (Van der Wolf et al., 1998).
7.3 Métodos PCR
Pueden utilizarse cebadores específicos de PCR (Pastrik et al, 2002; véase el apéndice 6) para diferenciar cepas que pertenezcan a la división 1 (biovares 3, 4 y 5) y la división 2 (biovares 1, 2A y 2T) de R. solanacearum, tal como se define originalmente con el análisis RFLP (Cook et al., 1989) y la secuenciación de 16S rADN (Taghavi et al., 1996).
C. PRUEBA DE CONFIRMACIÓN DE PATOGENICIDAD
Como confirmación final del diagnóstico de R. solanacearum y para la evaluación de la virulencia de cultivos identificados como R. solanacearum debe realizarse la prueba de patogenicidad:
1) preparar un inóculo de aproximadamente 106 células por ml de cultivos de 24 a 48 horas a partir del aislado que se vaya a someter a prueba y una cepa de control positivo adecuada de R. solanacearum (por ejemplo, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; véase el apéndice 3);
2) inocular entre cinco y diez tallos de plántulas de tomate o berenjena sensibles en la fase de la tercera hoja verdadera (véase la sección VI.A.9);
3) incubar durante un máximo de dos semanas a una temperatura de 25 a 28°C, con humedad relativa alta y riego adecuado, evitando tanto el estancamiento del agua como el estrés provocado por la sequía. Con los cultivos puros deberá obtenerse el marchitamiento típico en el plazo de 15 días. Si después de este período no se presentan los síntomas, no podrá confirmarse que el cultivo es una forma patógena de R. solanacearum;
4) comprobar si se aprecian síntomas de marchitamiento y/o epinastia, clorosis y crecimiento reducido;
5) aislar las plantas sintomáticas separando una sección de tallo que esté 2 cm por encima del punto de inoculación. Dilacerar y suspender en un pequeño volumen de agua destilada estéril o en tampón fosfato 50 mM (apéndice 4). Aislar de la suspensión mediante dilución, extendiendo o haciendo estrías en un medio adecuado, preferentemente en un medio selectivo (apéndice 2), incubar entre 48 y 72 horas a 28°C y examinar la formación de colonias típicas de R. solanacearum.
Apéndice 1
Laboratorios que han participado en la optimización y la validación de los protocolos
Laboratorio (1) ·
Ciudad ·
País ·
Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit ·
Viena y Linz ·
Austria ·
Departement Gewasbescherming ·
Merelbeke ·
Bélgica ·
Plantedirektoratet ·
Lyngby ·
Dinamarca ·
Central Science Laboratory ·
York ·
Inglaterra ·
Scottish Agricultural Science Agency ·
Edimburgo ·
Escocia ·
Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Unité Bactériologie ·
Angers ·
Francia ·
Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terre ·
Le Rheu ·
Francia ·
Biologische Bundesanstalt ·
Kleinmachnow ·
Alemania ·
Pflanzenschutzamt Hannover ·
Hannover ·
Alemania ·
State Laboratory ·
Dublín ·
Irlanda ·
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali ·
Bolonia ·
Italia ·
Regione Veneto Unità Periferica per i Servizi Fitosanitari ·
Verona ·
Italia ·
Nederlandse Algemene Keuringsdienst ·
Emmeloord ·
Países Bajos ·
Plantenziektenkundige Dienst ·
Wageningen ·
Países Bajos ·
Direcção-Geral de Protecção das Culturas ·
Lisboa ·
Portugal ·
Centro de Diagnóstico de Aldearrubia ·
Salamanca ·
España ·
Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias ·
Valencia ·
España ·
Swedish University of Agricultural Sciences ·
Uppsala ·
Suecia ·
(1) Científicos de contacto: véase el sitio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.
Apéndice 2
Medios para el aislamiento y el cultivo de R. solanacearum
a) Medios de cultivo en general
Agar nutritivo (NA)
Agar nutritivo (Difco): 23,0 g.
Agua destilada: 1,0 l.
Disolver los ingredientes y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
Agar de levadura, glucosa, peptona (YPGA)
Extracto de levadura (Difco): 5,0 g.
Bacto-peptona (Difco): 5,0 g.
D(+)-glucosa (monohidrato): 10,0 g.
Bacto-agar (Difco): 15,0 g.
Agua destilada: 1,0 l.
Disolver los ingredientes y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
Agar de sacarosa y peptona (SPA)
Sacarosa: 20,0 g.
Bacto-peptona (Difco): 5,0 g.
K2HPO4: 0,5 g.
MgSO4.7H2O: 0,25 g.
Bacto-agar (Difco) 15,0 g.
Agua destilada: 1,0 l.
pH 7,2-7,4
Disolver los ingredientes y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
Medio de tetrazolio de Kelman
Casaminoácidos (Difco): 1,0 g.
Bacto-peptona (Difco): 10,0 g.
Dextrosa: 5,0 g.
Bacto-agar (Difco): 15,0 g.
Agua destilada: 1,0 l.
Cristal violeta (Sigma): 5 mg por l.
Polimixina-B-Sulfato: (Sigma P-1004) 600.000 U (aproximadamente 100 mg) por l.
Bacitracina (Sigma B-0125): 1 250 U (aproxim. 25 mg) por l.
Cloranfenicol (Sigma C-3175): 5 mg por l.
Penicilina-G (Sigma P-3032): 825 U (aproximadamente 0,5 mg) por l.
Cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio (Sigma) 50 mg por l.
Disolver los ingredientes y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
Enfriar a 50°C y añadir una solución de cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio (Sigma), esterilizada por filtración, para conseguir una concentración final de 50 mg/l.
b) Medios de cultivo selectivo validados
Medio SMSA (Englebrecht, 1994, modificado por Elphinstone et al., 1996).
Medio de base
Casaminoácidos (Difco): 1,0 g.
Bacto-peptona (Difco): 10,0 g.
Glicerol: 5,0 ml.
Bacto-agar (Difco) (véase la nota 2): 15,0 g.
Agua destilada: 1,0 l.
Disolver los ingredientes y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
Enfriar a 50°C y añadir soluciones estándar acuosas, esterilizadas por filtración, de los siguientes ingredientes, a fin de obtener las concentraciones finales especificadas.
Nota:
1. La utilización de reactivos diferentes de los especificados arriba puede afectar al crecimiento de R. solanacearum.
2. Puede utilizarse Agar oxoide #1 en lugar de Bactoagar (Difco). En este caso, el crecimiento de R. solanacearum será más lento, aunque también puede reducirse el crecimiento de saprofitas competidoras. Las colonias típicas de R. solanacearum pueden necesitar de uno a dos días más para formarse y la coloración rojiza puede ser más ligera y difusa que en Bacto-agar.
3. Si se incrementa la concentración de bacitracina a 2 500 U por l pueden reducirse las poblaciones de bacterias competidoras sin que se vea afectado el crecimiento de R. solanacearum.
Almacenar los medios y las soluciones estándar de antibióticos a 4°C en la oscuridad y utilizar en el plazo de un mes.
Las placas deberán carecer de condensación de superficie antes de su utilización.
Evitar un secado excesivo de las placas.
Deberá efectuarse un control de calidad tras la preparación de cada nuevo lote de medio mediante siembra de una suspensión de un cultivo de referencia de R. solanacearum (véase el apéndice 3) y observación de la formación de colonias típicas después de incubación a 28°C de dos a cinco días.
c) Medios de enriquecimiento validados
Caldo SMSA (Elphinstone et al., 1996)
Preparar como para medio de agar selectivo SMSA pero omitir Bacto-agar y cloruro de 2,3,5-tetrazolio.
Caldo Wilbrink modificado (Caruso et al., 2002).
Sacarosa: 10 g.
Peptona proteosa: 5 g.
K2HPO4: 0,5 g.
MgSO4: 0,25 g.
NaNO3: 0,25 g.
Agua destilada: 1 l.
Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos y enfriar a 50°C.
Añadir soluciones estándar de antibióticos como para el caldo SMSA.
Apéndice 3
A. Material de control normalizado comercialmente disponible
a) Aislados bacterianos
Se recomiendan los siguientes aislados bacterianos para su utilización como material normalizado de referencia, bien como controles positivos (cuadro 1) o durante la optimización de las pruebas para evitar reacciones cruzadas (cuadro 2). Todas las cepas están comercializadas por:
1. National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science Laboratory, York, Reino Unido.
2. Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen, Países Bajos.
3. Collection Française de Bactéries Phytopathogènes (CFBP) — INRA Station Phytobactériologie, Angers, Francia.
Cuadro 1. Panel de referencia SMT de aislados de R. solanacearum
Código NCPPB ·
SMT# ·
Otros códigos ·
País de origen ·
Biovar ·
NCPPB 4153 ·
6 ·
CFBP 4582, Pr 3020, EURS11 ·
Egipto ·
2 ·
NCPPB 4154 ·
10 ·
CFBP 4585, 550, EURS21 ·
Turquía ·
2 ·
NCPPB 3857 ·
12 ·
CFBP 4587, Pr 1140, EURS26 ·
Inglaterra ·
2 ·
NCPPB 1584 ·
23 ·
CFBP 4598, EURS49 ·
Chipre ·
2 ·
NCPPB 2505 ·
24 ·
CFBP 4599, EURS50 ·
Suecia ·
2 ·
NCPPB 4155 ·
26 ·
CFBP 4601, 502, EURS55 ·
Bélgica ·
2 ·
NCPPB 4156 (*) ·
71(*) ·
PD 2762, CFBP 3857 ·
Países Bajos ·
2 ·
NCPPB 4157 ·
66 ·
LNPV 15.59 ·
Francia ·
2 ·
NCPPB 4158 ·
39 ·
CFBP 4608, Port 448, EURS80, NCPPB 4066 ·
Portugal ·
2 ·
NCPPB 4160 ·
69 ·
IVIA-1632-2 ·
España ·
2 ·
NCPPB 4161 ·
76 ·
B3B ·
Alemania ·
2 ·
NCPPB 325 ·
41 ·
CFBP 2047, KEL60-1, R842 ·
Estados Unidos ·
1 ·
NCPPB 3967 ·
42 ·
CFBP 4610, R285, GONg7 ·
Costa Rica ·
1 ·
NCPPB 4028 ·
43 ·
CFBP 4611, R303/571, CIP310, SEQ205 ·
Colombia ·
2 ·
NCPPB 3985 ·
44 ·
CFBP 4612, R578, CIP312 ·
Perú ·
2T ·
NCPPB 3989 ·
45 ·
CFBP 4613, R568, CIP226 ·
Brasil ·
2T ·
NCPPB 3996 ·
46 ·
CFBP 3928, R276/355, CIP72, SEQ225 ·
Perú ·
3 ·
NCPPB 3997 ·
47 ·
CFBP 4614, R280/363, CIP49, HAY0131a ·
Australia ·
3 ·
NCPPB 4029 ·
48 ·
CFBP 4615, R297/349, CIP121, CMIb2861 ·
Sri Lanka ·
4 ·
NCPPB 4005 ·
49 ·
CFBP 4616, R470 ·
Filipinas ·
4 ·
NCPPB 4011 ·
50 ·
CFBP 4617, R288, HEmps2 ·
China ·
5 ·
(*) Utilizar como cepa normalizada de referencia de R. solanacearum biovar 2 (raza 3).
Nota: La autenticidad de las cepas mencionadas solamente puede garantizarse.
Cuadro 2. Panel de referencia SMT de bacterias serológica o genéticamente relacionadas para su utilización en la optimización de las pruebas de detección
Código NCPPB ·
SMT # ·
Otro código ·
Identificación ·
NCPPB 4162 ·
51 ·
CFBP 1954 ·
Bacillus polymyxa (1) ·
NCPPB 4163 ·
52 ·
CFBP 1538 ·
Pseudomonas marginalis pv. Marginalis (1) ·
NCPPB 4164 ·
– ·
CFBP 2227 ·
Burkholderia cepacia (2) ·
NCPPB 4165 ·
– ·
CFBP 2459 ·
Ralstonia pickettii (2) ·
NCPPB 4166 ·
58 ·
CFBP 3567
CSL Pr1150
·
Ralstonia pickettii (1) ·
NCPPB 4167 ·
60 ·
CFBP 4618
PD 2778
·
Ralstonia sp. (1) ·
NCPPB 1127 ·
53 ·
CFBP 3575 ·
Burkholderia andropogonis (1) ·
NCPPB 353 ·
54 ·
CFBP 3572 ·
Burkholderia caryophylli (1) ·
NCPPB 945 ·
55 ·
CFBP 3569 ·
Burkholderia cepacia (1) ·
NCPPB 3708 ·
56 ·
CFBP 3574 ·
Burkholderia glumae (1) ·
NCPPB 3590 ·
57 ·
CFBP 3573 ·
Burkholderia plantarii (1) ·
NCPPB 3726 ·
59 ·
CFBP 3568 ·
Banana Blood Disease Bacterium (1) (2) (3) ·
NCPPB 4168 ·
61 ·
CFBP 4619
IPO S339
·
Enterobacter sp. (1) ·
NCPPB 4169 ·
62 ·
IPO 1695 ·
Enterobacter sp. (1) ·
NCPPB 4170 ·
63 ·
CFBP 4621
IPO S306
·
Ochrobactrum anthropi (1) (2) ·
NCPPB 4171 ·
64 ·
CFBP 4622
IPO 1693
·
Curtobacterium sp. (1) (2) ·
NCPPB 4172 ·
65 ·
IPO 1 696.ª ·
Pseudomonas sp. (1) ·
NCPPB 4173 ·
– ·
PD 2318 ·
Aureobacterium sp. (2) ·
NCPPB 4174 ·
81 ·
IVIA 1844.06 ·
Flavobacterium sp. (1) (2) ·
(1) Cepa que puede presentar reacción cruzada en pruebas serológicas (IF y/o ELISA) con antisueros policlonales.
(2) Cepa de la que puede amplificarse el producto de la PCR en algunos laboratorios de un tamaño similar al esperado utilizando cebadores específicos OLI1 y Y-2 (véase el apéndice 6).
(3) Probablemente tendrá reacciones cruzadas en la mayor parte de las pruebas, pero solamente se conoce su aparición en bananas en Indonesia.
b) Material de control normalizado comercialmente disponible
El siguiente material de control normalizado puede obtenerse a partir de un cultivo NCPPB:
Congelar precipitado seco de extracto de patata a partir de 200 tubérculos de patata sanos como control negativo para todas las pruebas.
Congelar precipitado seco de extracto de patata a partir de 200 tubérculos de patata sanos que contengan de 103 a 104 y 104 a 106 células de R. solanacearum biovar 2 (por ejemplo, cepa NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) como controles positivos para pruebas serológicas y PCR. Teniendo en cuenta que la viabilidad de las células se ve afectada durante la criodesecación, no son adecuados como controles normalizados para pruebas de aislamiento o de bioensayo.
Utilizar suspensiones fijadas con formalina de R. solanacearum biovar 2 (cepa NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) de 106 células por ml como controles positivos para pruebas serológicas.
B. Preparación de controles positivos y negativos
Preparar un cultivo de 48 horas de una cepa virulenta de R. solanacearum raza 3/biovar 2 (por ejemplo, cepa NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) en medio base SMSA y suspender en tampón fosfato 10 mM para obtener una densidad celular de aproximadamente 2 × 108 cfu por ml. Esto se obtiene normalmente mediante una suspensión ligeramente turbia equivalente a una densidad óptica de 0,15 a 600 nm.
Separar las cuñas basales de 200 tubérculos de una variedad de piel blanca conocida por estar exenta de R. solanacearum.
Procesar las cuñas basales como es habitual y resuspender el precipitado en 10 ml.
Preparar diez microviales estériles de 1,5 ml con 900 µl del precipitado resuspendido.
Transferir 100 µl de la suspensión de R. solanacearum al primer microvial. Homogeneizar por agitación.
Establecer niveles decimales de contaminación realizando nuevas diluciones en los cinco microviales siguientes.
Los seis microviales contaminados se utilizarán como controles positivos. Los cuatro microviales no contaminados se utilizarán como controles negativos. Etiquetar los microviales como corresponda.
Preparar alícuotas de 100 µl en microviales estériles de 1,5 ml para obtener de este modo nueve réplicas de cada muestra de control. Almacenar a una temperatura de –16 a –24°C hasta que se vayan a utilizar.
La presencia y la cuantificación de R. solanacearum en las muestras de control deberá confirmarse en primer lugar mediante una prueba IF.
Para la prueba PCR, extraer ADN de las muestras de control positivas y negativas para cada serie de muestras de ensayo.
Para las pruebas IF y FISH, realizar ensayos con las muestras de control positivas y negativas para cada serie de muestras de ensayo.
En las pruebas IF, FISH y PCR, debe detectarse R. solanacearum en al menos 106 y 104 células/ml de los controles positivos y en ninguno de los controles negativos.
Apéndice 4
Tampones para procedimientos de ensayo
GENERAL: Los tampones esterilizados que no se hayan abierto pueden almacenarse hasta un año.
1. Tampones para el procedimiento de extracción
1.1 Tampón de extracción (tampón fosfato 50 mM, pH 7,0)
Este tampón se utiliza para la extracción de la bacteria del tejido de las plantas mediante la homogeneización o la agitación.
Na2HPO4 (anhidro): 4,26 g.
KH2PO4: 2,72 g.
Agua destilada: 1,00 l.
Disolver los ingredientes, verificar el pH y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
Los siguientes componentes adicionales pueden resultar útiles:
·
Finalidad
·
Cantidad (por l)
·
Copos de Lubrol ·
Defloculante (*) ·
0,5 g ·
Compuesto DC silicona antiespumante ·
Antiespumante (*) ·
1,0 ml ·
Pirofosfato tetrasódico ·
Antioxidante ·
1,0 g ·
Polivinilpirrolidona-40000 (PVP-40) ·
Unir los inhibidores PCR ·
50 g ·
(*) Para su utilización en el método de extracción por homogeneización.
1.2 Tampón de precipitado (tampón fosfato 10 mM, pH 7,2)
Este tampón se utiliza para la resuspensión y la dilución de extractos de cuñas basales de tubérculos de patata tras la concentración en un precipitado mediante centrifugación.
Na2HPO4.12H2O: 2,7 g.
NaH2PO4.2H2O: 0,4 g.
Agua destilada: 1,0 l.
Disolver los ingredientes, verificar el pH y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
2. Tampones para la prueba IF
2.1 Tampón IF [tampón fosfato salino (PBS) 10 mM, pH 7,2]
Este tampón se utiliza para la dilución de anticuerpos.
Na2HPO4.12H2O: 2,7 g.
NaH2PO4.2H2O: 0,4 g.
NaCl: 8,0 g.
Agua destilada: 1,0 l.
Disolver los ingredientes, verificar el pH y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
2.2 Tampón IF-Tween
Este tampón se utiliza para lavar los portaobjetos.
Añadir 0,1% de Tween 20 al tampón IF.
2.3 Solución de glicerol con tampón de fosfato, pH 7,6
Este tampón se utiliza como fluido de montaje en los pocillos de los portaobjetos de IF para aumentar la fluorescencia.
Na2HPO4.12H2O: 3,2 g.
NaH2PO4.2H2O: 0,15 g.
Glicerol: 50 ml.
Agua destilada: 100 ml.
En el mercado pueden encontrarse soluciones de montaje que protegen la fluorescencia, como, por ejemplo, Vectashield® (Vector Laboratories) o Citifluor® (Leica).
3 Tampones para la prueba ELISA-indirecto
3.1 Tampón fuerza doble para tapizado, pH 9,6
Na2CO3: 6,36 g.
NaHCO3: 11,72 g.
Agua destilada: 1,00 l.
Disolver los ingredientes, verificar el pH y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
Puede añadirse como antioxidante sulfito de sodio (0,2%) si es necesario para evitar la acumulación de compuestos aromáticos oxidados.
3.2 Tampón fosfato salino (PBS), 10X pH 7,4
NaCl: 80,0 g.
KH2PO4: 2,0 g.
Na2HPO4.12H2O: 29,0 g.
KCl: 2,0 g.
Agua destilada: 1,0 l.
3.3 PBS-Tween
PBS 10X: 100 ml.
Tween 20 al 10%: 5 ml.
Agua destilada: 895 ml.
3.4 Tampón de bloqueo (anticuerpos) (debe prepararse en el momento de su utilización)
PBS 10X: 10,0 ml.
Polivinilpirrolidona-44000: 2,0 g.
(PVP-44).
Tween 20 al 10 %: 0,5 ml.
Leche en polvo: 0,5 g.
Agua destilada completar hasta: 100 ml.
3.5 Solución de sustrato fosfatasa alcalina, pH 9,8
Dietanolamina: 97 ml.
Agua destilada: 800 ml.
Mezclar y ajustar el pH a 9,8 con HCl concentrado.
Completar hasta 1 litro con agua destilada.
Añadir 0,2 g de MgCl2.
Disolver dos pastillas de 5 mg de sustrato fosfatasa (Sigma) por cada 15 ml de solución.
4 Tampones para la prueba ELISA-DASI
4.1 Tampón de tapizado, pH 9,6
Na2CO3: 1,59 g.
NaHCO3: 2,93 g.
Agua destilada: 1000 ml.
Disolver los ingredientes y comprobar el pH.
4.2 Tampón fosfato salino (PBS), 10X pH 7,2-7,4
NaCl: 80,0 g.
NaH2PO4.2H2O: 4,0 g.
Na2HPO4.12H2O: 27,0 g.
Agua destilada: 1000 ml.
4.3 PBS-Tween
10X PBS: 50 ml.
Tween 20 al 10%: 5 ml.
Agua destilada: 950 ml.
4.4 Tampón de sustrato, pH 9,8
Dietanolamina: 100 ml.
Agua destilada: 900 ml.
Mezclar y ajustar el pH a 9,8 con HCl concentrado.
Apéndice 5
Determinación del nivel de contaminación en las pruebas IF y FISH
1. Contar el número medio de células fluorescentes típicas por campo de visión (c).
2. Calcular el número de células fluorescentes típicas por pocillo del portaobjetos del microscopio (C):
donde:
S = superficie del pocillo del portaobjetos múltiple.
s = superficie del campo del objetivo.
donde:
i = coeficiente de campo (varía de 8 a 24 dependiendo del tipo ocular).
K = coeficiente del tubo (1 o 1,25).
G = aumentos del objetivo (100x, 40x, etc.).
3. Calcular el número de células fluorescentes típicas por ml de precipitado resuspendido (N):
donde:
y = volumen de precipitado resuspendido en cada pocillo.
F = factor de dilución del precipitado resuspendido.
Apéndice 6
Protocolos y reactivos PCR validados
Nota: Las pruebas preliminares deberán permitir la detección reproducible de al menos 103 a 104 células de R. solanacearum por ml de extracto de muestra.
Por otra parte, las pruebas preliminares no deben proporcionar resultados positivos falsos con respecto a un conjunto de cepas bacterianas seleccionadas (véase el apéndice 3).
1. Protocolo PCR de Seal et al. (1993)
1.1 Cebadores del oligonucleótido
Cebador directo OLI-1 5'-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3'
Cebador reverso Y-2 5'-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3'
Tamaño esperado del amplicón de los moldes de ADN de R. solanacearum = 288 pb.
1.2 Mezcla para la reacción PCR
Reactivo ·
Cantidad por reacción ·
Concentración final ·
Agua ultrapura estéril ·
17,65 µl ·
·
10x tampón PCR (1) (15 mM MgCl2) ·
2,5 µl ·
1x (1,5 mM MgCl2) ·
Mezcla dNTP (20 mM) ·
0,25 µl ·
0,2 mM ·
Cebador OLI-1 (20 µM) ·
1,25 µl ·
1µM ·
Cebador Y-2 (20 µM) ·
1,25 µl ·
1µM ·
Polimerasa Taq (5 U/µl) (1) ·
0,1 µl ·
0,5 U ·
Volumen de muestra ·
2,0 µl ·
·
Volumen total ·
25 µl ·
·
(1) El método se validó utilizando polimerasa Taq de Perkin Elmer (AmpliTaq) y Gibco BRL.
1.3 Condiciones de reacción PCR
Aplicar el siguiente programa:
1 ciclo de:
i) 2 minutos a 96°C (desnaturalización del molde de ADN)
35 ciclos de:
ii) 20 segundos a 94°C (desnaturalización del molde de ADN)
iii) 20 segundos a 68°C (hibridación de los cebadores)
iv) 30 segundos a 72°C (extensión de la copia)
1 ciclo de:
v) 10 minutos a 72°C (extensión final)
vi) mantener a 4°C
Nota: Este programa se optimizó para utilizarlo con un termociclador Perkin Elmer 9600. Puede ser preciso modificar la duración de los ciclos ii), iii) y iv) para su utilización con otros modelos.
1.4 Análisis de la enzima de restricción del amplicón
Los productos PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum producen un polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción característico con la enzima Ava II tras la incubación a 37°C.
2 Protocolo PCR de Pastrik y Maiss (2000)
2.1 Cebadores del oligonucleótido
Cebador directo Ps-1 5'- agt cga acg gca gcg ggg g -3'
Cebador reverso Ps-2 5'- ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca -3'
Tamaño esperado del amplicón de los moldes de ADN de R. solanacearum = 553 pb.
2.2 Mezcla para la reacción PCR.
Reactivo ·
Cantidad por reacción ·
Concentración final ·
Agua ultrapura estéril ·
16,025 µl ·
·
10x tampón PCR (1) ·
2,5 µl ·
1x (1,5 mM MgCl2) ·
BSA (fracción V) (10%) ·
0,25 µl ·
0,1% ·
Mezcla d-nTP (20 mM) ·
0,125 µl ·
0,1 mM ·
Cebador Ps-1 (10 µM) ·
0,5 µl ·
0,2 µM ·
Cebador Ps-2 (10 µM) ·
0,5 µl ·
0,2 µM ·
Polimerasa Taq (5 U/µl) (1) ·
0,1 µl ·
0,5 U ·
Volumen de muestra ·
5,0 µl ·
·
Volumen total ·
25,0 µl ·
·
(1) Los métodos se validaron utilizando polimerasa Taq de Perkin Elmer (AmpliTaq) y Gibco BRL.
Nota: Originalmente optimizado para termociclador MJ Research PTC 200 con polimerasa Gibco Taq.
También pueden utilizarse Perkin Elmer AmpliTaq y tampón con las mismas concentraciones.
2.3 Condiciones de reacción PCR
Aplicar el siguiente programa:
1 ciclo de:
i) 5 minutos a 95°C (desnaturalización del molde de ADN)
35 ciclos de:
ii) 30 segundos a 95°C (desnaturalización del molde de ADN)
iii) 30 segundos a 68°C (hibridación de los cebadores)
iv) 45 segundos a 72°C (extensión de la copia)
1 ciclo de:
v) 5 minutos a 72°C (extensión final)
vi) mantener a 4°C.
Nota: Este programa está optimizado para utilizarlo con un termociclador MJ Research PTC 200. Puede ser preciso modificar la duración de los ciclos ii), iii) y iv) para su utilización con otros modelos.
2.4 Análisis de la enzima de restricción del amplicón
Los productos PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum producen un polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción característico con la enzima Taq I tras la incubación a 65°C durante 30 minutos. Los fragmentos de restricción obtenidos a partir del fragmento específico de R. solanacearum tienen un tamaño de 457 pb y 96 pb.
3. Protocolo PCR multiplex con control PCR interno (Pastrik et al., 2002)
3.1 Cebadores del oligonucleótido
Cebador directo RS-1-F 5'- ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA -3'
Cebador reverso RS-1-R 5'- CCC AGT CAC GGC AGA GAC T -3'
Cebador directo NS-5-F 5'- AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G -3'
Cebador reverso NS-6-R 5'- GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC -3'
Tamaño esperado del amplicón de los moldes de ADN de R. solanacearum = 718 pb (conjunto de cebadores RS).
Tamaño esperado del amplicón de control PCR interno 18S rARN = 310 pb (conjunto de cebadores NS).
3.2 Mezcla para la reacción PCR
Reactivo ·
Cantidad por reacción ·
Concentración final ·
Agua ultrapura estéril ·
12,625 µl ·
·
10x tampón PCR (1) (15 mM MgCl2) ·
2,5 µl ·
1x (1,5 mM MgCl2) ·
BSA (fracción V) (10 %) ·
0,25 µl ·
0,1% ·
Mezcla d-nTP (20 mM) ·
0,125 µl ·
0,1 mM ·
Cebador RS-1-F (10 µM) ·
2,0 µl ·
0,8 µM ·
Cebador RS-1-R (10 µM) ·
2,0 µl ·
0,8 µM ·
Cebador NS-5-F (10 µM) (2) ·
0,15 µl ·
0,06 µM ·
Cebador NS-6-R (10 µM) (2) ·
0,15 µl ·
0,06 µM ·
Polimerasa Taq (5 U/µl) (1) ·
0,2 µl ·
1,0 U ·
Volumen de muestra ·
5,0 µl ·
·
Volumen total ·
25,0 µl ·
·
(1) Los métodos se validaron utilizando polimerasa Taq de Perkin Elmer (AmpliTaq) y Gibco BRL.
(2) La concentración de los cebadores NS-5-F y NS-6-R se optimizó para la extracción de cuñas basales de patata utilizando el método de homogeneización y purificación del ADN de acuerdo con Pastrik (2000) (véase la sección VI.A.6.1.a). Será necesario proceder a la reoptimización de las concentraciones de reactivos si se utilizan la extracción por agitación u otros métodos de aislamientodel ADN.
3.3 Condiciones de reacción PCR
Aplicar el siguiente programa:
1 ciclo de:
i) 5 minutos a 95°C (desnaturalización del molde de ADN)
35 ciclos de:
ii) 30 segundos a 95°C (desnaturalización del molde de ADN)
iii) 30 segundos a 58°C (hibridación de los cebadores)
iv) 45 segundos a 72°C (extensión de la copia)
1 ciclo de:
v) 5 minutos a 72°C (extensión final)
vi) mantener a 4°C.
Nota: Este programa está optimizado para utilizarlo con un termociclador MJ Research PTC 200. Puede ser preciso modificar la duración de los ciclos ii), iii) y iv) para su utilización con otros modelos.
3.4 Análisis de la enzima de restricción del amplicón
Los productos PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum producen un polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción característico con la enzima Bsm I o un Isoschizomere (por ejemplo, Mva 1269 I) tras la incubación a 65°C durante 30 minutos.
4. Protocolo PCR específico del biovar de R. solanacearum (Pastrik et al, 2001)
4.1 Cebadores del oligonucleótido
Cebador directo Rs-1-F 5'- ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA -3'
Cebador reverso Rs-1-R 5'- CCC AGT CAC GGC AGA GAC T -3'
Cebador reverso Rs-3-R 5'- TTC ACG GCA AGA TCG CTC -3'
Tamaño esperado del amplicón de los moldes de ADN de R. solanacearum:
con Rs-1-F/Rs-1-R = 718 pb
con Rs-1-F/Rs-3-R = 716 pb.
4.2 Mezcla para la reacción PCR
a) Biovar 1/2 específico PCR
Reactivo ·
Cantidad por reacción ·
Concentración final ·
Agua ultrapura estéril ·
12,925 µl ·
·
10X tampón PCR (1) ·
2,5 µl ·
1x (1,5 mM MgCl2) ·
BSA (fracción V) (10%) ·
0,25 µl ·
0,1% ·
Mezcla d-NTP (20 mM) ·
0,125 µl ·
0,1 mM ·
Cebador Rs-1-F (10 µM) ·
2 µl ·
0,8 µM ·
Cebador Rs-1-R (10 µM) ·
2 µl ·
0,8 µM ·
Polimerasa Taq (5 U/µl) (1) ·
0,2 µl ·
1 U ·
Volumen de muestra ·
5,0 µl ·
·
Volumen total ·
25,0 µl ·
·
(1) Los métodos se validaron utilizando polimerasa Taq de Perkin Elmer (AmpliTaq) y Gibco BRL.
b) Biovar 3/4/5 específico PCR
Reactivo ·
Cantidad por reacción ·
Concentración final ·
Agua ultrapura estéril ·
14,925 µl ·
·
10X tampón PCR (1) ·
2,5 µl ·
1x (1,5 mM MgCl2) ·
BSA (fracción V) (10%) ·
0,25 µl ·
0,1% ·
Mezcla dNTP (20 mM) ·
0,125 µl ·
0,1 mM ·
Cebador Rs-1-F (10 µM) ·
1 µl ·
0,4 µM ·
Cebador Rs-3-R (10 µM) ·
1 µl ·
0,4 µM ·
Polimerasa Taq (5 U/µl) (1) ·
0,2 µl ·
1 U ·
Volumen de muestra ·
5,0 µl ·
·
Volumen total ·
25,0 µl ·
·
(1) Los métodos se validaron utilizando polimerasa Taq de Perkin Elmer (AmpliTaq) y Gibco BRL.
4.3 Condiciones de reacción PCR
Aplicar el siguiente programa a las reacciones específicas de biovar 1/2 y biovar 3/4/5:
1 ciclo de:
i) 5 minutos a 95°C (desnaturalización del molde de ADN)
35 ciclos de:
ii) 30 segundos a 95°C (desnaturalización del molde de ADN)
iii) 30 segundos a 58°C (hibridación de los cebadores)
iv) 45 segundos a 72°C (extensión de la copia)
1 ciclo de:
v) 5 minutos a 72°C (extensión final)
vi) mantener a 4°C.
Nota: Este programa se optimizó para utilizarlo con un termociclador MJ Research PTC 200. Puede ser preciso modificar la duración de los ciclos ii), iii) y iv) para su utilización con otros modelos.
4.4 Análisis de la enzima de restricción del amplicón
Los productos PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum utilizando cebadores Rs-1-F y Rs-1-R producen un polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción característico con la enzima Bsm I o un Isoschizomere (por ejemplo, Mva 1269 I) tras la incubación a 65°C durante 30 minutos. Los productos PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum utilizando los cebadores Rs-1-F y Rs-3R no poseen sitios de restricción.
5. Preparación del tampón de carga
5.1 Azul de bromofenol (solución estándar al 10%)
Azul de bromofenol: 5 g.
Agua bidestilada: 50 ml.
5.2 Tampón de carga
Glicerol (86 %): 3,5 ml.
Azul de bromofenol (5,1) : 300 µl.
Agua bidestilada: 6,2 ml.
6. 10X tampón de tris acetato EDTA (TAE), pH 8,0
Tampón tris: 48,40 g.
Ácido acético glacial: 11,42 ml.
EDTA (sal disódica) : 3,72 g.
Agua destilada: 1,00 l.
Diluir a 1X antes de utilizarlo.
Se encuentra también disponible en el mercado (por ejemplo, Invitrogen o equivalente).
Apéndice 7
Reactivos validados para la prueba FISH
1. Oligosondas
Sonda específica para R. solanacearum OLI-1-CY3:
5'- GGC AGG TAG CAA GCT ACC CCC-3'
Sonda eubacteriana no específica EUB-338-FITC:
5'- GCT GCC TCC CGT AGG AGT -3'
2. Solución fijadora
¡ADVERTENCIA! LA SOLUCIÓN FIJADORA CONTIENE PARAFORMALDEHÍDO QUE ES TÓXICO. UTILIZAR GUANTES Y NO INHALAR. SE RECOMIENDA TRABAJAR EN UNA CAMPANA EXTRACTORA DE GASES.
i) Calentar 9 ml de agua de grado molecular, por ejemplo agua ultrapura, a 60°C aproximadamente y añadir 0,4 g de paraformaldehído. El paraformaldehído se disuelve cuando se añaden 5 gotas de 1N NaOH y se remueve con un agitador magnético.
ii) Ajustar el pH a 7,0 mediante la adición de 1 ml de tampón de fosfato de concentración 0,01 M y 5 gotas de 1N HCl. Verificar el pH con bandas indicadoras y ajustar si fuese necesario con HCl o NaOH. ¡ADVERTENCIA! NO UTILIZAR UN MEDIDOR DE PH EN SOLUCIONES QUE CONTENGAN PARAFORMALDEHÍDO.
iii) Filtrar la solución con un filtro de membrana de 0,22µm y mantener libre de polvo a 4°C hasta nueva utilización.
3. 3X Hybmix
NaCl: 2,7 M.
Tris-HCl: 60 mM (pH 7,4).
EDTA (filtro esterilizado con autoclave): 15 mM.
Diluir a 1X como se precisa.
4. Solución de hibridación
1X Hybmix.
Dodecilsulfato sódico (SDS): 0,01%.
Formamida: 30%.
Sonda EUB 338: 5 ng/µl.
Sonda OLI-1 o OLI-2: 5 ng/µl.
Preparar las cantidades de solución de hibridación de acuerdo con los cálculos de la tabla 1. Para cada portaobjetos (que contenga dos muestras distintas por duplicado) se precisan 90 µl de solución de hibridación. IMPORTANTE: DEBE TENERSE EN CUENTA QUE LA FORMAMIDA ES MUY TÓXICA, POR LO QUE DEBEN UTILIZARSE GUANTES Y TOMARSE LAS PRECAUCIONES DE SEGURIDAD NECESARIAS.
Tabla 1: Cantidades sugeridas para la preparación de la mezcla de hibridación
Número de portaobjetos ·
1 ·
4 ·
6 ·
8 ·
10 ·
Agua ultrapura estéril ·
23,1 ·
92,4 ·
138,6 ·
184,8 ·
231,0 ·
3X hybmix ·
30,0 ·
120,0 ·
180,0 ·
240,0 ·
300,0 ·
SDS al 1% ·
0,9 ·
3,6 ·
5,4 ·
7,2 ·
9,0 ·
Formamida ·
27,0 ·
108,0 ·
162,0 ·
216,0 ·
270,0 ·
Sonda EUB 338 (100 ng/µl) ·
4,5 ·
18,0 ·
27,0 ·
36,0 ·
45,0 ·
Sonda OLI-1 u OLI-2 (100 ng/µl) ·
4,5 ·
18,0 ·
27,0 ·
36,0 ·
45,0 ·
Volumen total (µl) ·
90,0 ·
360,0 ·
540,0 ·
720,0 ·
900,0 ·
Nota: Almacenar todas las soluciones que contengan oligosondas fotosensibles en la oscuridad a –20°C.
Proteger de la luz del sol o eléctrica directa durante su utilización.
5. Tampón fosfato 0,1 M, pH 7,0
Na2HPO4: 8,52 g.
KH2PO4: 5,44 g.
Agua destilada: 1,00 l.
Disolver los ingredientes, verificar el pH y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
Apéndice 8
Condiciones de cultivo para el tomate y la berenjena
Sembrar semillas de tomate (Lycopersicon esculentum) o berenjena (Solanum melongena) en compost pasteurizado de semillas. Trasplantar las plántulas con los cotiledones completamente abiertos (10 a 14 días) en compost pasteurizado de tiesto.
Las berenjenas o tomates deben cultivarse en un invernadero que cumpla las siguientes condiciones medioambientales antes de la inoculación:
Duración diurna: 14 horas o día natural si es de mayor duración
Temperatura:
diurna: 21 a 24°C.
nocturna:14 a 18°C.
Variedad de tomate sensible: ‘Moneymaker’.
Variedad de berenjena sensible:‘Black Beauty’.
Proveedores: véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/ Public/irc/sanco/Home/main.
REFERENCIAS
1. Amann, R.I., L. Krumholz and D.A. Stahl. 1990. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology. J. Bacteriol. 172: 762-770.
2. Anon. 1998. Council Directive 98/57/EC of 20 July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Official Journal of the European Communities L235, 1-39.
3. Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. Labarre and B. Jouan. 1999. Design of division specific primers of Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 105; 373-380.
4. Caruso, P., Gorris, M.T., Cambra, M., Palomo, J.L., Collar, J and Lopez, M.M. 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody for sensitive Detection of Ralstonia solanacearum in Asymptomatic Potato Tubers. Applied and Environmental Microbiology, 68, 36343638.
5. Cook, D., Barlow, E. and Sequeira, L. 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphisms with DNA probes that specify virulence and the hypersensitive response. Molecular Plant-Microbe Interactions 1:113-121.
6. Elphinstone, J.G., Hennessy, J., Wilson, J.K. and Stead, D.E. 1996. Sensitivity of detection of Ralstonia solanacearum in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26; 663678.
7. Englebrecht, M.C. (1994) Modification of a semiselective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. In: A.C. Hayward (ed.) Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Australian Centre for International Agricultural Research, Canberra, Australia.
8. Hayward, A.C. 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27; 265277.
9. Hayward, A.C., El-Nashaar, H.M., Nydegger, U. and De Lindo, L. 1990. Variation in nitrate metabolism in biovars of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 69; 269-280.
10. Ito, S., Y. Ushijima, T. Fujii, S. Tanaka, M. KameyaIwaki, S. Yoshiwara and F. Kishi. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia solanacearum in soil using a semi-selective medium and a PCR technique. J. Phytopathology 146; 379384.
11. Janse, J.D. (1988) A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 18, 343-351.
12. Janse, J.D. 1991. Infraand intra-specific classification of Pseudomonas solanacaerum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345.
13. Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44; 693-695.
14. Klement Z.; Rudolph, K and D.C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp.
15. Lelliott, R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd., Oxford. 216 pp.
16. López, M.M., Gorris, M.T., Llop, P., Cubero, J., Vicedo, B., Cambra, M., 1997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. In: H.W. Dehne et al., (eds). Klewer Academic Publishers. pp. 117-121.
17. Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1994. Specific genomic fingerprints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR. Applied and Environmental Microbiology, 60, 2286-2295.
18. Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J. 1995. Differentiation of genomic structure by repPCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85; 528-536.
19. Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J.-F Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A.C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Holloway, J.N. Timmis. 1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 5; 19-33.
20. Pastrik, K.H. and Maiss, E. 2000. Detection of R. solanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148; 619-626.
21. Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842.
22. Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D. (1995) Production of antibodies to Pseudomonassolanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79.
23. Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. 3. ed.; St. Paul, Minnesota: 373 pp.
24. Seal, S.E., L.A. Jackson, J.P.W. Young, and M.J. Daniels. 1993. Detection of Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood Disease Bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139: 15871594.
25. Smith, J.J., Offord, L.C., Holderness, M. and Saddler, G.S. 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonymPseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61; 4262-4268.
26. Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295.
27. Taghavi, M., Hayward, A.C., Sly, L.I., Fegan, M. 1996. Analysiss of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46; 10-15.
28. Van Der Wolf, J.M., Bonants, P.J.M., Smith, J.J., Hagenaar, M., Nijhuis, E., Van Beckhoven, J.R.C., Saddler, G.S., Trigalet, A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 in Western Europe as determined by AFLP, RC-PFGE and rep-PCR. In: Prior, P., Allen, C. and Elphinstone, J. (eds.) Bacterial wilt disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 4449.
29. Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead, D.E. and Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and quantitative flourogenic 5’ nuclease TaqMan assay. Applied and Environmental Microbiology 66; 2853-2858.
30. Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L. Akkermans. 1998. Detection of R. solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546-4554.