ANEXO III

ANEXO III

Protocolo para el diagnóstico de Fusarium circinatum Niremberg et O´donnell en semillas

El método que se establece para la detección de Fusarium circinatum Niremberg et O´donnell en semillas se ha elaborado teniendo en consideración el método ISTA para la detección de Fusarium moniliforme var. subglutinans en Pinus taeda y Pinus elliotii (2002).

Sin embargo, dado que las semillas no se esterilizan bajo riesgo de eliminar el patógeno buscado, existe la posibilidad de obtener falsos negativos debido a la contaminación por otras especies de Fusarium o al enmascaramiento por la presencia de otros hongos contaminantes. Por ello se considera importante la identificación del patógeno en cultivo puro. También se ha observado que el número de identificaciones positivas en partidas de semillas examinadas es muy bajo y por este motivo en el presente método se establece un mínimo de semillas a procesar superior al determinado por el método ISTA.

I. Metodología

Se procesarán 500 semillas de cada lote de acuerdo al siguiente método:

1. Siembra directa de las semillas sin lavado ni esterilización previa en medios de cultivo PDAS (250 semillas) y Komada (250 semillas).

2. Las placas se incubarán en la oscuridad a 25 ºC durante 4 semanas y se observarán periódicamente, repicando las colonias de Fusarium que vayan apareciendo a medio de cultivo PDA.

3. Obtención de cultivos monospóricos de estas colonias.

4. Identificación cultural y morfológica:

a) Repicar cada cultivo monospórico a PDA para poder estudiar las características culturales y a SNA (Spezieller Nährstoffarmer Agar) y CLA (Carnation Leaf Agar) para estudiar las características morfológicas.

b) Incubar las placas en estos medios de cultivo a 25 ºC en oscuridad durante 10 días, al cabo de los cuales se observa:

1.º En PDA, las características culturales: en el caso de Fusarium circinatum Niremberg et O´donnell se observarán colonias de micelio algodonoso de color blanco grisáceo a rosado o violeta.

2.º Observación bajo microscopio de las características morfológicas: en SNA se observará la presencia de microconidios e hifas estériles enrolladas, y en CLA se observará la presencia de los microconidios y los macroconidios. En el caso de Fusarium circinatum Niremberg et O´donnell se observarán los microconidios en polifiálidas, ausencia de cadenas de conidios, presencia de hifas estériles enrolladas y ausencia de clamidosporas.

5. Identificación molecular:

a) Realizar la extracción de ADN de los cultivos monospóricos de los aislados sospechosos morfológicamente.

b) Seguir el protocolo de PCR descrito por Schweigkofler et al. (2004), donde, en caso positivo, se obtendrá un fragmento de 360 pb.

Cebadores:	CIRC1A (5´CTTGGCTCGAGAAGGG).
	CIRC4A (5´ACCTACCCTACACCTCTCACT).

Condiciones: Desnaturalización a 94 ºC durante 180 segundos, seguida de 45 ciclos de 94 ºC durante 35 segundos, 66 ºC durante 55 segundos, y 72 ºC durante 50 segundos y con una extensión final de 72 ºC durante 12 minutos.

II. Medios de cultivo

a) Medio Komada (Komada, 1975).

K₂HPO₄: 1,0 g.

KCL: 500 mg.

MgSO₄· 7H₂O: 500 mg.

Fe-Na-EDTA: 10 mg.

L-asparagina: 2,0 g.

D-galactosa: 20,0 g.

Agar: 15,0 g.

Agua: 1,0 L.

Autoclavar a 121 ºC durante 20 minutos y dejar enfriar un poco.

Añadir la siguiente solución de suplementos previamente mezclados, esterilizados por filtración y con el pH bien ajustado a 3,8 ± 0,2 con una solución de ácido fosfórico al 10%.

Pentacloronitrobenceno: 1,0 g (PNCB, 75 % WP).

Oxgall: 500 mg.

Na₂B₄O7· 10H₂O: 1,0 g.

Sulfato de estreptomicina: 300 mg.

b) SNA (Spezieller-Nährstoffarmer Agar).

KH₂PO₄: 1,0 g.

KNO₃: 1,0 g.

MgSO₄· 7H₂O: 0,5 g.

KCL: 0,5 g.

Glucosa: 0,2 g.

Sacarosa: 0,2 g.

Agar Oxoid N.º 3: 20,0 g.

Agua destilada: 1,0 L.

Disolver todos los ingredientes excepto el agar. Ajustar el pH a 6 - 6,5. Añadir y disolver el agar. Autoclavar a 121 ºC durante 20 minutos.

c) CLA (carnation leaf agar, agar de hoja de clavel).

Agar: 20,0 g.

Agua destilada: 1,0 L.

Autoclavar a 121 ºC durante 20 minutos. Esterilizar las hojas de clavel a 121 ºC durante 20 minutos y colocarlas sobre la superficie del agar.

III. Referencias

KOMADA, H., 1975. Development of a selective medium for quantitative isolation of Fusarium oxysporum from natural soil. Rev. Plant Protec. Res. 8: 114-125.

SCHWEIGKOFLER, W.; O´DONNELL, K. y GARBELOTTO, M., 2004. Detection and quantification of airborne conidia of Fusarium circinatum, the causal agent of pine pitch canker, from two California sites by using a real-time PCR approach combined with a simple spore trapping method. Applied and Environmental Microbiology 70, 2004, 3512-3520.

7-009: Detection of Fusarium moniliforme var. subglutinans on Pinus spp. International Rules for Seed Testing. Annexe to Chapter 7: Seed Health Testing Methods. Published by: International Seed Testing Association (ISTA). Bassersdorf, Switzerland, 2002. p: 1-8.