ANEXO

ANEXO

Métodos de análisis alternativos

Parte A.

Definiciones:

Bacteria coliforme: Miembro de la familia Enterobacteriaceae que expresa el enzima -D-galactosidasa.

Escherichia coli: Miembro de la familia Enterobacteriaceae que expresa los enzimas -D-galactosidasa y -D-glucuronidasa.

Parte B.

Método de detección y recuento de bacterias coliformes y de Escherichia coli en aguas de consumo por filtración de membrana utilizando agar cromogénico para coliformes (ACC).

Procedimiento:

– Filtrar la muestra a través de una membrana de ésteres de celulosa o equivalente, testadas con arreglo a la norma ISO 7704:1985, de 0,45 µm de diámetro de poro, que retenga los microorganismos. Colocar la membrana sobre una placa conteniendo el ACC.

– Incubar la placa durante 21 ± 3 horas a 36 ± 2 ºC. Si a las 18 horas aparecen colonias rojas o incoloras, prolongar la incubación hasta las 24 horas para incluir posibles reacciones tardías de beta-galactosidasa o beta-glucuronidasa.

– Contar las colonias -galactosidasa positivas y -glucuronidasa negativas (color rosa asalmonado a rojo) como bacterias coliformes distintas a Escherichia coli. Contar las colonias -galactosidasa positivas y -glucuronidasa positivas (color azul oscuro a violeta) como Escherichia coli. El recuento de bacterias coliformes totales corresponderá a la suma de las colonias de color rosa asalmonado a rojo y las colonias de color azul oscuro a violeta.

Cálculo de resultados: A partir del volumen de agua filtrado y del número de colonias características contadas sobre la membrana, calcular la concentración de bacterias coliformes y de Escherichia coli en 100 ml de muestra.

Expresión de resultados: Los resultados se expresarán como UFC/100 ml.

Composición del método de cultivo:

Medio base (1 litro):

Peptona: 3,0 g.

Cloruro sódico: (NaCl): 5,0 g.

Dihidrogenofosfato sódico (NaH2PO4): 2,2 g.

Hidrogenofosfato disódico (Na2HPO4): 2,7 g.

Triptófano: 1,0 g.

Piruvato sódico: 1,0 g.

Tergitol® 7: 0,15 g.

Sorbita: 1,0 g.

Mezcla cromógena: Salmon-GAL (0,2 g) y X-Glucuronido (0,2 g).

Agar: 10 g.

Agua destilada: 1.000 ml.

Suspender los ingredientes en agua calentando al baño maría o en vapor fluente con agitación frecuente hasta completa disolución. El pH final debe ser de 6,8 ± 0,2 a 25 ºC. No autoclavar ni sobrecalentar.

Solución de vancomicina (5 ml):

Vancomicina HCl: 5 mg.

Agua destilada: 5 ml.

Disolver la vancomicina en agua y esterilizar por filtración de membrana de 0,2 µm de diámetro de poro.

Solución de cefsulodina (5 ml):

Sal sódica de cefsulodina: 5 mg.

Agua destilada: 5 ml.

Disolver la sal sódica de cefsulodina en agua y esterilizar por filtración de membrana de 0,2 µm de diámetro de poro.

Para el estudio de equivalencia se reemplazo ambas soluciones (solución vancomicina y solución cefsulodina) por el suplemento comercial.

Medio completo:

Medio base: 1000 ml.

Solución de vancomicina: 5 ml.

Solución de cefsulodina: 5 ml.

Fundir el medio base y atemperar hasta 45-50 ºC. Añadir de modo aséptico las soluciones de vancomicina y de cefsulodina. Homogeneizar evitando la formación de burbujas.

Repartir en placas de Petri. Almacenar a 5 ± 3 ºC en la oscuridad hasta un plazo máximo de un mes.

En el estudio de equivalencia se empleó el medio Chromocult Coliform Agar, fabricado por la casa comercial Merck.

Parte C.

Método de detección y recuento de bacterias coliformes y de Escherichia coli en aguas de consumo por el NMP (número más probable) en medio líquido utilizando la tecnología del sustrato definido® (DST).

Materiales específicos del método:

Frascos estériles con enrase a 100 ml.

Bandeja multipocillos: Para recuentos hasta 200,5/100 ml.

Dosis de sustrato definido: Reactivo dosificado para un ensayo.

Selladora.

Lámpara de luz UV de 365 nm.

Tablas del NMP para bandeja de 51 pocillos.

Procedimiento:

– Introducir 100 ml de muestra en un envase estéril de 100 ml de capacidad. Añadir una dosis de sustrato definido y agitar hasta completa disolución. Introducir en una bandeja. Colocar la bandeja en una selladora para repartir la muestra entre los distintos pocillos, que quedarán aislados entre sí.

– Incubar la bandeja entre 18 y 22 horas a 36 ± 2 ºC.

– Contar los pocillos de color amarillo como positivos para bacterias coliformes. Utilizando una lámpara de luz UV de 365 nm, marcar los pocillos que presenten fluorescencia azulada. Contar como positivos para Escherichia coli los pocillos a la vez amarillos y fluorescentes.

Cálculo de resultados:

– A partir del número de pocillos amarillos contados en la bandeja, buscar en la tabla del NMP correspondiente el de bacterias coliformes en 100 ml de muestra.

– A partir del número de pocillos a la vez amarillos y fluorescentes contados en la bandeja, buscar en la tabla del NMP el de Escherichia coli en 100 ml de muestra.

Expresión de resultados:

Los resultados se expresarán como NMP/100 ml.

En caso de obtenerse Ausencia, este resultado equivale a 0 UFC/100 ml.

En el estudio de equivalencia se empleó la bandeja Quanti-Tray® de 51 pocillos y el sustrato definido Colilert 18®.

Redactado conforme a la corrección de errores publicada en BOE núm. 103, de 28 de abril de 2009. BOE-A-2009-7048