ANEXO 2

ANEXO 2
Diagnóstico de brucelosis bovina
A) Seroaglutinación
1. Identificación del agente.
La tasa demostración, mediante tinción inmunoespecífica o ácido-resistente modificada, de aglutininas antibrucella la presencia de un suero deberá expresarse organismos con morfología de Brucella en unidades internacionales material procedente de abortos, flujo vaginal o leche indica posibilidad de brucelosis, especialmente en caso de que dicha demostración se vea confirmada por mililitros.
2. La lectura resultados de pruebas serológicas.
Una vez aislados los microorganismos, deben identificarse la seroaglutinación lenta en tubo debe hacerse al 50 especie y el biovar mediante lisis por 100 fagos o al 75 por 100 pruebas del metabolismo oxidativo y criterios de aglutinación, cultivo, bioquímicos y el antígeno utilizado habrá sido titulado serológicos.
Las técnicas y medios utilizados, su normalización y la interpretación de los resultados deben ajustarse a lo dispuesto en presencia los capítulos 2.3.1 (brucelosis bovina) y 2.4.2 (brucelosis caprina y ovina) de la cuarta edición de 2000 del suero patrón.
3. La capacidad Manual de aglutinación normas para pruebas de diagnóstico y vacunas de la OIE.
2. Pruebas inmunológicas.
2.1 Patrones.
2.1.1 Para la preparación de todos los diversos antígenos respecto al utilizados en las pruebas de rosa de Bengala, de aglutinación del suero, de fijación del complemento y del anillo en leche deberá utilizarse la cepa Weybridge 99 o la cepa USDA 1119-3 del biovar 1 de Brucella abortus.
2.1.2 El suero patrón deberá estar comprendida entre de referencia para las pruebas arriba mencionadas es el suero patrón de referencia internacional de la OIE, anteriormente denominado segundo suero anti-Brucella abortus internacional de la OMS.
2.1.3 Los sueros patrón de referencia para las pruebas ELISA son los límites siguientes:
a) Si El suero patrón de referencia internacional de la lectura se realiza al 50 por 100: Entre 1/600 y 1/1.000 OIE.
b) Si El suero patrón ELISA débilmente positivo de la lectura se realiza al 75 por 100: Entre 1/500 y 1/750. OIE.
4. Para c) El suero patrón ELISA fuertemente positivo de la preparación del antígeno destinado a OIE.
d) El suero patrón ELISA negativo de la seroaglutinización OIE.
2.1.4 Los sueros patrón arriba mencionados pueden obtenerse en tubos (método lento) se utilizarán las cepas la Agencia de Laboratorios Veterinarios (Veterinary Laboratories Agency, VLA) de Weybridge número 99 y USDA 1119 (Reino Unido).
2.1.5 Los sueros patrón mencionados en el apartado 2.1.3 son patrones primarios internacionales de los cuales deben establecerse para cada prueba en cada Estado miembro patrones nacionales secundarios de referencia (en adelante, ``de trabajo'').
2.2 Pruebas de inmunoabsorción enzimática (ELISA) u otras pruebas aglutinantes para la detección de sensibilidad equivalente. la brucelosis bovina en suero o leche.
5. Para efectuar 2.2.1 Material y reactivos.
La técnica empleada y la interpretación de los resultados deberán haberse validado de conformidad con los principios establecidos en el capítulo 1.1.3 de la cuarta edición de 2000 del Manual de normas para pruebas de diagnóstico y vacunas de la OIE y deberán incluir al menos estudios de laboratorio y de diagnóstico.
2.2.2 Normalización de la prueba.
2.2.2.1 Normalización del procedimiento de la prueba para muestras individuales de suero:
a) Una pre-dilución al 1/150 (1) de suero patrón de referencia internacional de la OIE, una seroaglutinación se prepararán, pre-dilución al menos, tres diluciones 1/2 de suero patrón ELISA débilmente positivo de la OIE o una pre-dilución al 1/16 de suero patrón ELISA fuertemente positivo de la OIE realizada en un suero negativo (o en una mezcla de sueros negativos) debe dar reacción positiva.
b) Una pre-dilución al 1/600 de suero patrón de referencia internacional de la OIE, una pre-dilución al 1/8 de suero patrón ELISA débilmente positivo de la OIE o una pre-dilución al 1/64 de suero patrón ELISA fuertemente positivo de la OIE realizada en un suero negativo (o en una mezcla de sueros negativos) debe dar reacción negativa.
c) El suero patrón ELISA negativo de la OIE debe dar siempre reacción negativa.
2.2.2.2 Normalización del procedimiento de la prueba para cada suero. muestras mezcladas de suero:
a) Una pre-dilución al 1/150 de suero patrón de referencia internacional de la OIE, una pre-dilución al 1/2 de suero patrón ELISA débilmente positivo de la OIE o una pre-dilución al 1/16 de suero patrón ELISA fuertemente positivo de la OIE realizada en un suero negativo (o en una mezcla de sueros negativos) y diluida de nuevo en sueros negativos por el número de muestras que componen la mezcla debe dar reacción positiva.
b) El suero patrón ELISA negativo de la OIE debe dar siempre reacción negativa.
c) La dilución prueba debe ser capaz de detectar indicios de infección en un solo animal del suero problema se realizará grupo de tal forma animales de los que se hayan mezclado muestras de suero.
2.2.2.3 Normalización del procedimiento de la lectura prueba para muestras mezcladas de leche o de lactosuero:
a) Una pre-dilución al 1/1000 de suero patrón de referencia internacional de la OIE, una pre-dilución al 1/16 de suero patrón ELISA débilmente positivo de la OIE o una pre-dilución al 1/125 de suero patrón ELISA fuertemente positivo de la OIE realizada en un suero negativo (o en una mezcla de sueros negativos) y diluida de nuevo al 1/10 en leche negativa, debe dar reacción positiva.
b) El suero patrón ELISA negativo de la OIE diluido al límite 1/10 en leche negativa debe dar siempre reacción negativa.
c) La prueba debe ser capaz de detectar indicios de infección se efectúe en un solo animal del grupo de animales de los que se hayan mezclado muestras de leche o de lactosuero.
2.2.3 Condiciones para el tubo empleo de enmedio. En las pruebas ELISA en el caso diagnóstico de reacción positiva la brucelosis bovina:
2.2.3.1 Si se emplean las condiciones de calibración arriba mencionadas para las pruebas ELISA con muestras de suero, la sensibilidad de diagnóstico de las pruebas ELISA debe ser igual o superior a la de la prueba de rosa de Bengala o a la de la prueba de fijación del complemento, teniendo en cuenta la situación epidemiológica en la que se utilicen.
2.2.3.2 Si se emplean las condiciones de calibración arriba mencionadas para las pruebas ELISA con muestras de leche mezcladas, la sensibilidad de diagnóstico de las pruebas ELISA debe ser igual o superior a la de la prueba del anillo en leche, teniendo en cuenta no sólo la situación epidemiológica, sino también los sistemas de cría de ganado medios y extremos que cabe esperar.
2.2.3.3 Si las pruebas ELISA se emplean para la certificación de conformidad con el artículo 6.1 del Real Decreto 1716/2000, o para el establecimiento y mantenimiento del estatuto de un rebaño de conformidad con el punto 11 de la parte II del anexo I de dicho tubo, real decreto, debe llevarse a cabo una mezcla de muestras de suero de forma que los resultados de las pruebas puedan vincularse sin ningún género de dudas a los distintos animales incluidos en el conjunto. Toda prueba de confirmación debe llevarse a cabo con muestras de suero problema contendrá como mínimo la cantidad tomadas de animales por separado.
2.2.3.4 Las pruebas ELISA pueden utilizarse con una muestra de leche tomada de la leche recogida en una explotación con al menos un 30 U.I. aglutinantes % de vacas lecheras en fase de producción de leche. Si se emplea este método, deben aplicarse medidas a fin de que las muestras tomadas para su examen puedan vincularse sin ningún género de dudas a los distintos animales de los que procede la leche. Toda prueba de confirmación debe llevarse a cabo con muestras de suero tomadas de animales por mililitro. separado.
B) Reacción 2.3 Prueba de fijación de del complemento (FdC).
1. 2.3.1 El suero patrón contendrá por mililitro 1.000 unidades sensibilizantes; estas unidades se denominan unidades sensibilizadoras CEE.
2. La tasa antígeno consiste en una suspensión bacteriana en solución salina de anticuerpos fijadores fenol [NaCl al 0,85 % (m/v) y fenol al 0,5 % (v/v)] o en solución amortiguadora de complemento veronal. Los antígenos pueden presentarse en un suero se expresará forma concentrada, siempre que en unidades CEE. la etiqueta del frasco se indique el factor de dilución que debe utilizarse. El antígeno debe almacenarse a 4 oC y no debe congelarse.
3. 2.3.2 Los sueros deben ser inactivados inactivarse de la siguiente forma: suero manera siguiente:
Suero bovino: a una temperatura de 56 a 60 ºC durante treinta a cincuenta oC entre 30 y 50 minutos.
4. Para 2.3.3 Con objeto de provocar la preparación reacción genuina en el procedimiento de antígeno la prueba, se utilizarán las cepas Weybridge número 99 y USDA 1119. debe usar una dosis de complemento superior a la mínima necesaria para lograr una hemólisis completa.
5. Cuando se efectúe 2.3.4 Al realizar la reacción prueba de fijación de complemento es necesario proceder del complemento, deben efectuarse cada vez a los controles siguientes:
a) Control del efecto anticomplementario del suero.
b) Control del antígeno.
c) Control de los hematíes sensibilizados.
d) Control de del complemento.
e) Control, con la ayuda de un suero positivo, Control de la sensibilidad al desencadenamiento principio de la reacción. reacción, mediante un suero positivo.
f) Control de la especificidad de la reacción con la ayuda de reacción, mediante un suero negativo.
C) Criterios 2.3.5 Cálculo de interpretación
Sueros negativos: los resultados.
1. Los procedentes El suero patrón de animales no vacunados o vacunados referencia internacional de edad superior a los treinta meses que presenten un título brucélico inferior a 30 la OIE (OIEISS) contiene 1000 unidades internacionales aglutinantes de prueba FdC por mililitro y resultado negativo mililitro. Si este suero patrón se somete a la prueba mediante un método dado, el resultado se expresa como título (Toieiss). El resultado de fijación la prueba con el suero problema, indicado como título (Tsuero problema), debe expresarse en unidades internacionales de complemento.
2. Los procedentes prueba FdC por mililitro. El factor de animales vacunados conversión (F) necesario para pasar el título de edad inferior a los treinta meses que presenten un título brucélico igual o superior suero problema desconocido (Tsuero problema), examinado mediante dicho método, a 30 su expresión en unidades internacionales aglutinantes por mililitro pero inferior a 80 unidades, debiendo presentar en este caso a la reacción de fijación de complemento: prueba FdC puede averiguarse mediante la siguiente fórmula:
- Un título inferior a 30 F = 1000 x 1 TOIEISS
y el contenido de unidades CEE, cuando se trate internacionales de hembras vacunadas hace menos prueba FdC por mililitro de doce meses. suero problema (UIPFdCsuero problema) mediante la siguiente:
- Un título inferior a UIPFDCSUERO PROBLEMA = F X TSUERO PROBLEMA
2.3.6 Interpretación de los resultados.
Se considera positivo un suero que contenga 20 o más unidades CEE en el resto internacionales de los casos. prueba FdC por mililitro.
D) 2.4 Prueba del antígeno brucelar tamponado
a) Método manual: anillo en leche.
1. 2.4.1 El suero patrón es el segundo suero patrón internacional «antibrucella abortus» suministrado por el Laboratorio Central Veterinario antígeno consiste en una suspensión bacteriana en solución salina de Weybridge, Surrey (Inglaterra).
2. fenol [NaCl al 0,85 % (m/v) y fenol al 0,5 % (v/v)] marcada con hematoxilina. El antígeno se preparará sin referencia debe almacenarse a la concentración celular, pero su 4 oC y no debe congelarse.
2.4.2 La sensibilidad del antígeno debe ser contrastada estar normalizada en relación con el suero patrón de referencia internacional de manera la OIE, de forma que el antígeno produzca una dé reacción positiva para una dilución de suero de 1:47,5 y una reacción negativa para una dilución de 1:55.
3. El antígeno tamponado a pH 3,65 ± 0,5 y coloreado con rosa bengala.
4. Para preparar el antígeno se utilizará la cepa número 99 de Weybridge o la cepa USDA 1119 u otra cepa de sensibilidad equivalente.
5. El antígeno será testado frente a ocho sueros liofilizados identificados como positivos y negativos.
6. La prueba deberá realizarse de la forma siguiente:
1.º Poner una gota (0,03 ml) de antígeno y una gota (0,03 ml) dilución al 1/500 de este suero sobre una placa blanca.
2.º Con la ayuda de un agitador proceder a la mezcla.
3.º Agitar a continuación la placa con movimientos alternativos de delante a atrás (alrededor de 10 movimientos por minuto, durante cuatro minutos).
4.º Efectuar la lectura bajo luz suficiente; patrón en ausencia de aglutinación la prueba se considerará como negativa; toda aglutinación permite considerar la prueba como positiva a menos leche negativa, mientras que se haya producido un secado excesivo sobre los bordes.
b) Método automático:
El método automático debe tener con una dilución al menos igual sensibilidad que el método manual.
E) Prueba del anillo 1/1000 dé reacción negativa.
1. 2.4.3 La prueba del anillo se realizará sobre debe efectuarse con muestras que representen el contenido de cada cántara o cisterna de leche cada cisterna de la explotación.
2. La normalización del antígeno de la OMS: el antígeno será coloreado con hematoxilina o tetrazolium.
3. Si la prueba se realiza sobre leche sin conservantes, la reacción deberá efectuarse entre las dieciocho y las veinticuatro horas posteriores al ordeño.
Cuando la prueba se realiza pasadas las veinticuatro horas de la toma de la muestra se adicionarán como agentes conservadores al formol o el cloruro de mercurio. En este caso, el plazo en que puede efectuarse la reacción es de catorce días después de la toma de muestra.
Cuando se use formol o cloruro de mercurio, la dilución final en la muestra de leche será del 0,2 por 100, y la proporción entre la cantidad 2.4.4 Las muestras de leche y la solución de formol será, al menos, de 10 no deben haberse congelado, calentado ni sometido a 1. fuerte agitación.
4. 2.4.5 La reacción deberá realizarse según debe llevarse a cabo utilizando uno de los métodos siguientes:
a) En Con una columna de leche de al menos 25 milímetros mm de altura y con un volumen de leche de 1 mililitro a la ml al que se adicionarán hayan añadido 0,03 mililitros ml o 0,05 mililitros ml de antígeno. uno de los antígenos marcados normalizados.
b) En Con una columna de leche de al menos 25 milímetros mm de altura y con un volumen de leche de 2 mililitros con adición de ml al que se hayan añadido 0,05 mililitros ml de antígeno. uno de los antígenos marcados normalizados.
c) En Con un volumen de leche de 8 mililitros y ml al que se habrá hayan añadido 0,08 mililitros ml de antígeno. uno de los antígenos marcados normalizados.
5. 2.4.6 La mezcla de leche y antígeno se pondrá en estuche antígenos debe incubarse a 37 ºC oC durante cuarenta y cinco minutos como mínimo 60 minutos, junto con patrones de trabajo negativo y sesenta minutos como máximo. positivo. La evaluación se realizará en el plazo sensibilidad de quince minutos siguientes a la salida de prueba aumenta si se prorroga la estufa. incubación a 4 oC durante un período de entre 16 y 24 horas.
6. Los criterios 2.4.7 Interpretación de interpretación serán: los resultados:
a) Reacción negativa: Leche leche coloreada, crema nata incolora.
b) Reacción positiva. reacción positiva:
Leche y crema coloreadas nata de forma idéntica o idéntico color.
O leche incolora y crema nata coloreada.
F) 2.5 Prueba de inmunoabsorción enzimática (ELISA) para la detección rosa de brucelosis bovina Bengala en placa.
1. Los materiales reactivos que habrán de utilizarse 2.5.1 El antígeno consiste en una suspensión bacteriana en diluyente de antígeno de brucela tamponado a un pH de 3,65 > 0,05, marcado con el método ELISA son los siguientes:
a) Microplacas colorante rosa de fase sólida, platillos o cualquier otra fase sólida. Bengala. El antígeno debe suministrarse listo para su uso, debe almacenarse a 4 oC y no debe congelarse.
b) 2.5.2 El antígeno no se fijará a prepara en función de la fase sólida concentración celular, sino que su sensibilidad debe normalizarse con o sin ayuda relación al suero patrón de anticuerpos captores policlonales o monoclonales. referencia internacional de la OIE de forma que el antígeno dé reacción positiva con una dilución de suero al 1/45 y reacción negativa con una dilución al 1/55.
c) El líquido biológico 2.5.3 La prueba de rosa de Bengala en placa debe realizarse de la manera siguiente:
a) Se mezclan 20-30 ll de suero con un volumen igual de antígeno en una placa blanca de porcelana o de esmalte para obtener una zona con un diámetro de 2 cm, aproximadamente. La mezcla se agita suavemente durante 4 minutos a temperatura ambiente, tras lo que deba examinarse. se observa con buena iluminación para ver si se ha producido aglutinación.
d) Un control positivo b) Se puede utilizar un método automatizado, pero debe ser al menos tan sensible y negativo. exacto como el método manual.
e) El conjugado. 2.5.4 Interpretación de los resultados.
f) Un sustrato adaptado Toda reacción visible debe considerarse positiva, a menos que se observe un exceso de sequedad alrededor de los enzimas utilizados. bordes.
g) En su caso, cada serie de pruebas deben incluirse patrones de trabajo positivos y negativos.
2.6 Prueba de aglutinación del suero.
2.6.1 El antígeno consiste en una suspensión bacteriana en una solución salina de parada. fenol [NaCl al 0,85 % (m/v) y fenol al 0,5 % (v/v)]. No debe utilizarse formaldehído.
h) Soluciones para Los antígenos pueden presentarse en forma concentrada, siempre que en la etiqueta del frasco se indique el factor de dilución que debe utilizarse.
Se puede añadir EDTA a la suspensión de muestras antígeno hasta alcanzar una dilución final de ensayo, para las preparaciones prueba de reactivos y 5 mM para reducir el lavado.
i) Un sistema nivel de lectura apropiado al sustrato utilizado.
2. Condiciones falsos positivos en la prueba de utilización e interpretación aglutinación del suero. Posteriormente, se debe reajustar el pH de 7,2 en la prueba ELISA para suspensión de antígeno.
2.6.2 El suero patrón de referencia internacional de la detección OIE contiene 1000 unidades internacionales de brucelosis bovina: aglutinación.
a) 2.6.3 El método ELISA podrá practicarse sobre muestras antígeno no se prepara en función de suero, la concentración celular, sino que su sensibilidad debe normalizarse con relación al suero patrón de lactosuero referencia internacional de la OIE de forma que el antígeno produzca una aglutinación del 50 % con una dilución final del suero entre el 1/600 y el 1/1000, o una aglutinación del 75 % con una dilución final del suero entre el 1/500 y el 1/750.
También puede resultar recomendable comparar la reactividad entre lotes de leche antígeno nuevos y lotes de antígeno normalizados anteriormente utilizando un grupo de sueros definidos.
2.6.4 La prueba se realiza en tubos o en microplacas. La mezcla de antígeno y diluciones de suero debe incubarse durante un período de 16 a granel, siempre 24 horas a 37º C.
De cada suero deben prepararse al menos tres diluciones. Las diluciones de suero sospechoso deben realizarse de forma que ésta proceda la lectura de una explotación donde la reacción al menos límite de positividad se realice en el 30 por 100 tubo intermedio (o en el pocillo intermedio en el caso del método de las vacas lecheras estén microplacas).
2.6.5 Interpretación de los resultados.
El grado de aglutinación de Brucella en período un suero debe expresarse en UI/ml.
Se considera positivo un suero que contenga 30 o más UI/ml.
3. Pruebas complementarias.
3.1 Prueba cutánea de lactación. la brucelosis.
3.1.1 Condiciones para el empleo de esta prueba:
a) La prueba cutánea de la brucelosis no debe emplearse para fines de certificación en el comercio intracomunitario.
b) Cuando se utiliza Esta prueba es una de las posibilidades antes citadas, deberán adaptarse las medidas que garanticen más específicas para la correspondencia entre muestras tomadas y los animales detección de los que procedan la leche o suero que presencia de brucelosis en animales no vacunados ; no obstante, no se examinan. debe realizar el diagnóstico únicamente a partir de reacciones intradérmicas positivas.
c) Las muestras Debe considerarse que están infectados los animales de leche a granel la especie bovina que se considerarán negativas cuando den hayan sometido a una reacción inferior al 50 por 100 de las pruebas serológicas definidas en este anexo con un resultado negativo y que reaccionen positivamente a la prueba cutánea de la brucelosis.
d) Los animales de la especie bovina que ofrezca se hayan sometido a una dilución de leche negativa de 1 las pruebas serológicas definidas en 10.000 del segundo suero patrón internacional este anexo con un resultado positivo pueden someterse a una prueba cutánea de la brucelosis en para confirmar la leche negativa.
d) Las muestras individuales interpretación de suero se considerarán negativas los resultados de las pruebas serológicas, especialmente cuando den no pueda excluirse una reacción inferior al 10 por 100 cruzada con anticuerpos de otras bacterias en el caso de los rebaños indemnes de brucelosis u oficialmente indemnes de brucelosis.
3.1.2 La prueba debe llevarse a cabo mediante un preparado alergénico de la brucelosis normalizado y definido que ofrezca no contenga lipopolisacárido liso antigénico, ya que éste puede provocar reacciones inflamatorias inespecíficas o interferir con pruebas serológicas posteriores.
Un preparado de tales características es la brucelina INRA, que procede de una dilución cepa no lisa de 1 B. melitensis. Sus condiciones de producción aparecen descritas detalladamente en 200 la sección B2 del segundo suero patrón internacional capítulo 2.4.2 de la cuarta edición de 2000 del Manual de normas para pruebas de diagnóstico y vacunas de la OIE.
3.1.3 Procedimiento de la prueba.
3.1.3.1 Se inyecta por vía intradérmica un volumen de 0,1 ml de alergeno de la brucelosis en solución salina el pliegue caudal, en la piel de la ijada o cualquier otra reconocida. en un lado del cuello.
e) Si 3.1.3.2 La prueba se lee una vez transcurridas de las muestras diera una reacción positiva, se aplicarán controles serológicos individuales hasta obtener un resultado negativo en al menos dos pruebas individuales practicadas con intervalos 48 a 72 horas.
3.1.3.3 Antes de tres meses como mínimo la inyección y de doce como máximo, en el momento de conformidad la lectura, se mide con las disposiciones anteriormente citadas, y en un laboratorio directamente supervisado por pie de rey el Centro Nacional grosor de Referencia. la piel en el lugar de la inyección.
El suero patrón 3.1.3.4 Interpretación de los resultados.
Las reacciones fuertes se reconocen fácilmente por la prueba ELISA inflamación y la induración locales.
Se considera que la reacción a la prueba cutánea de la brucelosis es positiva si se produce un aumento del resto grosor de pruebas serológicas para la detección piel de brucelosis será preparado por 1,5 a 2 mm.
3.2 Prueba de inmunoabsorción enzimática de competición (ELISAc).
3.2.1 Condiciones para el Centro Nacional empleo de Referencia esta prueba:
a) La ELISAc no debe emplearse con fines de brucelosis certificación en el comercio intracomunitario.
b) La ELISAc ha mostrado tener mayor especificidad que, por ejemplo, la ELISA indirecta, y por consiguiente puede usarse para confirmar la interpretación de Granada, los resultados de las pruebas serológicas.
3.2.2 Procedimiento de la prueba.
La prueba debe realizarse de acuerdo con el patrón párrafo a) del Laboratorio Veterinario apartado 2 del capítulo 2.3.1 de Weybridge (Inglaterra). Dicho suero deberá contener 1.000 U. I. aglutinantes por mililitro la cuarta edición de suero bovino. 2000 del Manual de normas para pruebas de diagnóstico y vacunas de la OIE.
G) 4. Laboratorio Nacional de Referencia Referencia.
4.1 El Laboratorio Central de Sanidad Animal (Laboratorio de Sanidad y Producción Animal Animal) de Santa Fe (Granada), perteneciente al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, Camino del Jau s/n, 18320, es el designado como Centro Laboratorio Nacional de Referencia para la brucelosis en animales.
4.2 Tareas y responsabilidades. Las tareas y responsabilidad del Laboratorio Nacional de Referencia, sin perjuicio de lo dispuesto en los artículos 9, 11 y 14 y en la disposición transitoria cuarta, son las siguientes:
a) Aprobación de los resultados de los estudios de validación que demuestren la fiabilidad del método de prueba utilizado en España.
b) Determinación del número máximo de muestras que deben mezclarse en las baterías de ELISA utilizadas.
c) Calibración de los sueros patrón nacionales secundarios de referencia ("patrones de trabajo") frente al suero patrón primario internacional mencionado en el apartado 2.1.
d) Controles de calidad de todos los lotes de antígenos y de baterías de ELISA utilizados en España.
e) Cooperación dentro de la red de laboratorios nacionales de referencia para la brucelosis de la Unión Europea.
(1) A efectos de este anexo, las diluciones para preparar los reactivos líquidos se expresan, por ejemplo, como 1/150, lo que indica una dilución de 1 en 150.