ANEXO 2

ANEXO 2
Diagnóstico de brucelosis bovina
1. Identificación del agente.
La agente.–La demostración, mediante tinción inmunoespecífica o ácido-resistente acidorresistente modificada, de la presencia de organismos con morfología de Brucella brucela en material procedente de abortos, flujo vaginal o leche indica posibilidad implica una presunción de brucelosis, especialmente si se corrobora con pruebas serológicas. Los métodos de reacción en caso cadena de que dicha demostración se vea confirmada la polimerasa ofrecen métodos de detección adicionales.
En la medida de lo posible, las bacterias del género brucela deben aislarse con medios simples o selectivos, por resultados cultivo a partir de pruebas serológicas. flujos uterinos, fetos abortados, secreciones mamarias o tejidos seleccionados, como ganglios linfáticos y órganos reproductores masculinos y femeninos.
Una vez aislados los microorganismos, aisladas las bacterias, deben identificarse la especie y el biovar la biovariedad mediante lisis por fagos o pruebas del metabolismo oxidativo y criterios de cultivo, bioquímicos y serológicos. La reacción en cadena de la polimerasa puede ofrecer un método complementario y biotipológico basado en secuencias genómicas específicas.
Las técnicas y los medios utilizados, su normalización y normalización, así como la interpretación de los resultados deben ajustarse a lo dispuesto en los capítulos 2.3.1 el capítulo 2.4.3 (brucelosis bovina) y 2.4.2 bovina), 2.7.2 (brucelosis caprina y ovina) de la cuarta edición de 2000 y 2.8.5 (brucelosis porcina) del Manual de normas para pruebas las Pruebas de diagnóstico Diagnóstico y vacunas de las Vacunas para los Animales Terrestres de la OIE. OIE, sexta edición, de 2008.
2. Pruebas inmunológicas.
2.1 Patrones. Estándares.
2.1.1 Para la preparación de todos los antígenos utilizados en las pruebas de del rosa de Bengala, de aglutinación del suero, seroaglutinación, de fijación del complemento y del anillo en de leche deberá utilizarse la cepa se utilizarán las cepas Weybridge 99 o la cepa USDA 1119-3 del biovar de la biovariedad 1 de Brucella abortus.
2.1.2 El suero patrón de referencia para Para las pruebas arriba mencionadas es del rosa de Bengala, de seroaglutinación, de fijación del complemento y del anillo de leche se utilizará el suero patrón estándar de referencia internacional de la OIE, anteriormente denominado segundo suero anti-Brucella abortus internacional de la OMS. OMS (ISAbS).
2.1.3 Los sueros patrón estándar de referencia para las pruebas ELISA son los enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) serán los siguientes:
a) El suero patrón estándar de referencia internacional de la OIE.
b) El suero patrón ELISA estándar débilmente positivo de la OIE. OIE para ELISA.
c) El suero patrón ELISA estándar fuertemente positivo de la OIE. OIE para ELISA.
d) El suero patrón ELISA estándar negativo de la OIE. OIE para ELISA.
2.1.4 Los sueros patrón arriba mencionados pueden obtenerse en estándar de referencia para los ensayos de fluorescencia polarizada serán los siguientes:
El suero estándar débilmente positivo de la Agencia OIE para ELISA.
El suero estándar fuertemente positivo de Laboratorios Veterinarios (Veterinary Laboratories Agency, VLA) la OIE para ELISA.
El suero estándar negativo de Weybridge (Reino Unido). la OIE para ELISA.
2.1.5 Los sueros patrón estándar mencionados en el apartado los puntos 2.1.3 y 2.1.4 pueden obtenerse en el laboratorio comunitario de referencia para la brucelosis o la Veterinary Laboratories Agency (VLA), Weybridge, Reino Unido.
2.1.6 El suero estándar de referencia internacional de la OIE y los sueros estándar débilmente positivo, fuertemente positivo y negativo de la OIE para ELISA son patrones estándares primarios internacionales a partir de los cuales deben establecerse para cada prueba en cada Estado miembro patrones sueros estándar nacionales secundarios de referencia (en adelante, ``de trabajo''). lo sucesivo, estándares de trabajo) para cada prueba mencionada en el punto 2.1.1.
2.2 Pruebas Enzimoinmunoanálisis de inmunoabsorción enzimática adsorción (ELISA) u otras pruebas aglutinantes otros análisis de saturación para la detección de la brucelosis bovina en suero o leche.
2.2.1 Material y reactivos.
La reactivos.–La técnica empleada y la interpretación de los resultados deberán haberse validado de conformidad con los principios establecidos en el capítulo 1.1.3 de la cuarta edición de 2000 1.1.4 del Manual de normas para pruebas las Pruebas de diagnóstico Diagnóstico y vacunas de las Vacunas para los Animales Terrestres de la OIE y deberán incluir OIE, sexta edición, de 2008, e incluirán al menos estudios de laboratorio y de diagnóstico.
2.2.2 Normalización de la prueba.
2.2.2.1 Normalización del procedimiento de la prueba para muestras individuales de suero:
a) Una pre-dilución predilución al 1/150 (1) de suero patrón estándar de referencia internacional de la OIE, una pre-dilución predilución al 1/2 de suero patrón ELISA estándar débilmente positivo de la OIE para ELISA o una pre-dilución predilución al 1/16 de suero patrón ELISA estándar fuertemente positivo de la OIE realizada para ELISA en un suero negativo (o en una mezcla de sueros negativos) debe deberán dar una reacción positiva. positiva;
b) Una pre-dilución predilución al 1/600 de suero patrón estándar de referencia internacional de la OIE, una pre-dilución predilución al 1/8 de suero patrón ELISA estándar débilmente positivo de la OIE para ELISA o una pre-dilución predilución al 1/64 de suero patrón ELISA estándar fuertemente positivo de la OIE realizada para ELISA en un suero negativo (o en una mezcla de sueros negativos) debe deberán dar una reacción negativa. negativa;
c) El suero patrón ELISA estándar negativo de la OIE debe para ELISA deberá dar siempre una reacción negativa.
2.2.2.2 Normalización del procedimiento de la prueba para muestras mezcladas de suero:
a) Una pre-dilución predilución al 1/150 de suero patrón estándar de referencia internacional de la OIE, una pre-dilución predilución al 1/2 de suero patrón ELISA estándar débilmente positivo de la OIE para ELISA o una pre-dilución predilución al 1/16 de suero patrón ELISA estándar fuertemente positivo de la OIE realizada para ELISA en un suero negativo (o en una mezcla de sueros negativos) y diluida diluidas de nuevo en sueros negativos por el número de muestras que componen la mezcla debe deberán dar una reacción positiva. positiva;
b) El suero patrón ELISA estándar negativo de la OIE debe para ELISA deberá dar siempre una reacción negativa. negativa;
c) La prueba debe deberá ser capaz de adecuada para detectar indicios de infección en un solo animal del grupo de animales de los que se hayan mezclado cuyas muestras de suero. suero se han mezclado.
2.2.2.3 Normalización del procedimiento de la prueba para muestras mezcladas de leche o de lactosuero:
a) Una pre-dilución predilución al 1/1000 de suero patrón estándar de referencia internacional de la OIE, una pre-dilución predilución al 1/16 de suero patrón ELISA estándar débilmente positivo de la OIE para ELISA o una pre-dilución predilución al 1/125 de suero patrón ELISA estándar fuertemente positivo de la OIE realizada para ELISA en un suero negativo (o en una mezcla de sueros negativos) y diluida diluidas de nuevo al 1/10 en leche negativa, debe negativa deberán dar una reacción positiva. positiva;
b) El suero patrón ELISA estándar negativo de la OIE para ELISA diluido al 1/10 en leche negativa debe deberá dar siempre una reacción negativa. negativa;
c) La prueba debe deberá ser capaz de adecuada para detectar indicios de infección en un solo animal del grupo de animales de los que se hayan mezclado cuyas muestras de leche o de lactosuero. lactosuero se hayan mezclado.
2.2.3 Condiciones para el empleo la utilización de las pruebas ELISA en el diagnóstico de la brucelosis bovina: bovina.
2.2.3.1 Si se emplean En las condiciones de calibración arriba mencionadas para las pruebas ELISA con indicadas en los puntos 2.2.2.1 y 2.2.2.2 sobre las muestras de suero, la sensibilidad de diagnóstico de las dichas pruebas ELISA debe deberá ser igual o superior a la de la prueba de del rosa de Bengala o a la de la prueba de fijación del complemento, teniendo en cuenta la situación epidemiológica en la que se utilicen. realicen.
2.2.3.2 Si se emplean En las condiciones de calibración arriba mencionadas para las pruebas ELISA con indicadas en el punto 2.2.2.3 sobre muestras mezcladas de leche mezcladas, leche, la sensibilidad de diagnóstico de las dichas pruebas ELISA debe deberá ser igual o superior a la de la prueba del anillo en de leche, teniendo en cuenta no sólo solo la situación epidemiológica, sino también los sistemas de cría de ganado medios y extremos que cabe esperar. previsiblemente extremos.
2.2.3.3 Si las pruebas ELISA se emplean para la certificación de conformidad con el artículo 6.1 del Real Decreto 1716/2000, de 13 de octubre, o para el establecimiento y mantenimiento del estatuto de un rebaño de conformidad con el punto 11 de la parte II del anexo I de dicho real decreto, debe llevarse a cabo una la mezcla de las muestras de suero deberá realizarse de forma que los resultados de las pruebas puedan vincularse sin ningún género de dudas duda a los distintos animales incluidos en el conjunto. cuyas muestras se hayan mezclado. Toda prueba de confirmación debe llevarse a cabo deberá efectuarse con muestras de suero tomadas de animales por separado.
2.2.3.4 Las pruebas ELISA pueden podrán utilizarse con una muestra de leche tomada de la leche recogida en una explotación con que tenga al menos un 30 % 30% de vacas lecheras en fase de producción de leche. Si se emplea este ese método, deben deberán aplicarse medidas a fin de para que las muestras tomadas para su examen examinadas puedan vincularse sin ningún género de dudas duda a los distintos animales de los que procede la leche. Toda prueba de confirmación debe llevarse a cabo deberá efectuarse con muestras de suero tomadas de animales por separado.
2.3 2.3. Prueba de fijación del complemento (FdC).
2.3.1 El antígeno consiste en una suspensión bacteriana en solución salina de fenol [NaCl al 0,85 % 0,85% (m/v) y fenol al 0,5 % 0,5% (v/v)] o en una solución amortiguadora de veronal. Los antígenos pueden podrán presentarse en forma concentrada, siempre que en la etiqueta del frasco se indique el factor de dilución que debe utilizarse. El antígeno debe almacenarse se almacenará a 4 oC °C y no debe congelarse. se congelará.
2.3.2 Los sueros deben inactivarse se inactivarán de la manera siguiente:
Suero bovino: a una temperatura de 56 a 60 oC entre °C durante 30 y a 50 minutos.
Suero porcino: 60 °C durante 30 a 50 minutos.
2.3.3 Con objeto de provocar la reacción genuina en el procedimiento de la prueba, se debe usar utilizará una dosis de complemento superior a la mínima necesaria para lograr una hemólisis hemolisis completa.
2.3.4 Al realizar la prueba de fijación del complemento, deben efectuarse se efectuarán, cada vez vez, los controles siguientes:
a) Control del efecto anticomplementario del suero.
b) Control del antígeno.
c) Control de los hematíes eritrocitos sensibilizados.
d) Control del complemento.
e) Control de la sensibilidad sensibilidad, mediante un suero positivo, al principio de la reacción, mediante un suero positivo. reacción.
f) Control de la especificidad de la reacción, mediante un suero negativo.
2.3.5 Cálculo de los resultados.
El resultados.–El suero patrón estándar de referencia internacional de la OIE (OIEISS) contiene 1000 unidades internacionales de prueba FdC por mililitro. Si este suero patrón se somete a prueba mediante con un método dado, concreto, el resultado se expresa como expresará mediante un título (Toieiss). (dilución directa más alta del suero estándar de referencia internacional de la OIE que permita obtener una hemolisis del 50%, TOIEISS). El resultado de la prueba con el suero problema, problema indicado como título (Tsuero problema), debe expresarse (TSUERO PROBLEMA) se expresará en unidades internacionales de prueba FdC por mililitro. El factor de conversión (F) necesario para pasar el del título de un suero problema desconocido (Tsuero problema), (TSUERO PROBLEMA) examinado mediante por dicho método, método a su expresión en unidades internacionales de prueba FdC puede averiguarse mediante podrá determinarse con la siguiente fórmula: fórmula siguiente:
F = 1000 x 1 TOIEISS 000 × 1/TOIEISS
y el contenido de unidades internacionales de prueba FdC por mililitro de suero problema (UIPFdCsuero problema) mediante (UIPFdCSUERO PROBLEMA) podrá determinarse con la fórmula siguiente:
UIPFDCSUERO UIPFdCSUERO PROBLEMA = F X × TSUERO PROBLEMA
2.3.6 Interpretación de los resultados.
Se considera resultados.–Se considerará positivo un suero que contenga 20 o más unidades internacionales de prueba FdC por mililitro.
2.4 Prueba del anillo en de leche.
2.4.1 El antígeno consiste en una suspensión bacteriana en solución salina de fenol [NaCl al 0,85 % 0,85% (m/v) y fenol al 0,5 % 0,5% (v/v)] marcada con hematoxilina. El antígeno debe almacenarse se almacenará a 4 oC °C y no debe congelarse. se congelará.
2.4.2 La sensibilidad del antígeno debe deberá estar normalizada en relación con el relación al suero patrón estándar de referencia internacional de la OIE, de forma que el antígeno dé una reacción positiva con una dilución al 1/500 de este dicho suero patrón estándar en leche negativa, mientras que con una dilución al 1/1000 dé la reacción deberá ser negativa.
2.4.3 La prueba del anillo debe efectuarse se hará con muestras que representen el contenido de cada cántara lechera o de cada cisterna depósito a granel de la explotación.
2.4.4 Las muestras de leche no deben haberse se habrán congelado, calentado ni sometido a fuerte agitación. agitado fuertemente.
2.4.5 La reacción debe llevarse a cabo utilizando se provocará con uno de los métodos siguientes:
Con En una columna de leche de al menos 25 mm de altura y con un volumen de leche de 1 ml al que se hayan habrán añadido 0,03 ml o 0,05 ml de uno de los antígenos marcados normalizados. estándar marcados.
Con En una columna de leche de al menos 25 mm de altura y con un volumen de leche de 2 ml al que se hayan habrán añadido 0,05 ml de uno de los antígenos marcados normalizados. estándar marcados.
Con En un volumen de leche de 8 ml al que se hayan habrán añadido 0,08 ml de uno de los antígenos marcados normalizados. estándar marcados.
2.4.6 La mezcla de leche y antígenos debe deberá incubarse a 37 oC °C durante 60 minutos, junto con patrones estándares de trabajo negativo positivos y positivo. La sensibilidad de la prueba aumenta si se prorroga la negativos. Posteriormente, una incubación a 4 oC durante un período de entre 16 y 24 horas. horas a 4 °C aumentará la sensibilidad de la prueba.
2.4.7 Interpretación de los resultados:
a) Reacción negativa: leche coloreada, nata incolora.
b) reacción Reacción positiva:
Leche leche y nata de idéntico color.
O idéntica coloración, o leche incolora y nata coloreada.
2.5 Prueba del antígeno de brucela amortiguado (prueba del rosa de Bengala en placa. Bengala).
2.5.1 El antígeno consiste en una suspensión bacteriana en diluyente de antígeno de brucela tamponado amortiguado a un pH de 3,65 > ± 0,05, marcado con el colorante rosa de Bengala. El antígeno debe suministrarse se suministrará listo para su uso, debe almacenarse se almacenará a 4 oC °C y no debe congelarse. se congelará.
2.5.2 El antígeno no se prepara preparará sin tener en función de cuenta la concentración celular, sino que pero su sensibilidad debe normalizarse deberá estar normalizada con relación al suero patrón estándar de referencia internacional de la OIE de forma que el antígeno dé una reacción positiva con una dilución de suero al 1/45 y una reacción negativa con una dilución al 1/55.
2.5.3 La prueba de del rosa de Bengala en placa debe realizarse se realizará de la manera siguiente:
a) Se mezclan 20-30 ll μl de suero con un el mismo volumen igual de antígeno en una placa blanca de porcelana o de esmalte para obtener una zona con de un diámetro aproximado de 2 cm, aproximadamente. La mezcla cm; se agita suavemente la muestra durante 4 minutos a temperatura ambiente, tras lo que ambiente y a continuación se observa con buena iluminación para ver si se ha producido aglutinación.
b) Se puede utilizar Podrá utilizarse un método automatizado, pero debe deberá ser al menos tan sensible y exacto como el método manual.
2.5.4 Interpretación de los resultados.
Toda resultados.–Toda reacción visible debe deberá considerarse positiva, a menos que se observe haya un exceso de sequedad alrededor de los bordes.
En cada serie de pruebas deben incluirse patrones se incluirán estándares de trabajo positivos y negativos.
2.6 Prueba de aglutinación del suero. seroaglutinación.
2.6.1 El antígeno consiste consistirá en una suspensión bacteriana en una solución salina de fenol [NaCl al 0,85 % 0,85% (m/v) y fenol al 0,5 % 0,5% (v/v)].
No debe utilizarse se utilizará formaldehído.
Los antígenos pueden podrán presentarse en forma concentrada, siempre que en la etiqueta del frasco se indique el factor de dilución que debe deberá utilizarse.
Se puede podrá añadir EDTA a la suspensión de antígeno hasta alcanzar una dilución final de prueba de 5 mM para reducir el nivel de falsos positivos en la prueba de aglutinación del suero. seroaglutinación. Posteriormente, se debe reajustar reajustará el pH de 7,2 en la suspensión de antígeno.
2.6.2 El suero patrón estándar de referencia internacional de la OIE contiene 1000 unidades internacionales de aglutinación.
2.6.3 El antígeno no se prepara preparará sin tener en función de cuenta la concentración celular, sino que pero su sensibilidad debe deberá normalizarse con relación al suero patrón estándar de referencia internacional de la OIE de forma que el antígeno produzca una aglutinación del 50 % 50% con una dilución final del suero entre el del 1/600 y el al 1/1000, o una aglutinación del 75 % 75% con una dilución final del suero entre el del 1/500 y el al 1/750.
También puede resultar ser recomendable comparar la reactividad entre lotes de antígeno nuevos y lotes de antígeno previamente normalizados anteriormente utilizando un grupo de sueros definidos.
2.6.4 La prueba se realiza realizará en tubos o en microplacas. La mezcla de antígeno y diluciones de suero debe incubarse se incubará durante un período de 16 a 24 horas a 37º C. 37 °C.
De cada suero deben prepararse Se prepararán al menos tres diluciones. diluciones para cada suero. Las diluciones de suero sospechoso deben realizarse se realizarán de forma que la lectura de la reacción al límite de positividad se realice haga en el tubo intermedio (o en el pocillo intermedio en el caso del método de las microplacas). con microplaca).
2.6.5 Interpretación de los resultados.
El resultados.–El grado de aglutinación de Brucella brucela en un suero debe expresarse se expresará en UI/ml.
Se considera considerará positivo un suero que contenga 30 o más UI/ml.
2.7 Ensayo de fluorescencia polarizada.
2.7.1 El ensayo de fluorescencia polarizada podrá efectuarse en un tubo de cristal o una placa de 96 pocillos. La técnica utilizada, su normalización y la interpretación de los resultados deberán ser conformes a lo especificado en el capítulo 2.4.3 (brucelosis bovina) del Manual de las Pruebas de Diagnóstico y de las Vacunas para los Animales Terrestres de la OIE, sexta edición, de 2008.
2.7.2 Normalización de la prueba.–El ensayo de fluorescencia polarizada se normalizará de tal manera que:
a) El suero estándar fuertemente positivo de la OIE para ELISA y el suero estándar débilmente positivo de la OIE para ELISA den constantemente resultados positivos.
b) Una predilución al 1/8 de suero estándar débilmente positivo de la OIE para ELISA o una predilución al 1/64 de suero estándar fuertemente positivo de la OIE para ELISA en un suero negativo (o en una mezcla de sueros negativos) den siempre una reacción negativa.
c) El suero estándar negativo de la OIE para ELISA dé siempre una reacción negativa.
En cada batería de pruebas se incluirá suero estándar de trabajo fuertemente positivo, débilmente positivo y negativo (calibrados respecto a los sueros estándar de la OIE para ELISA).
3. Pruebas complementarias.
3.1 Prueba cutánea de la brucelosis.
3.1.1 Condiciones para el empleo uso de esta prueba: la prueba cutánea de la brucelosis.
a) La prueba cutánea de la brucelosis no debe emplearse para se utilizará con fines de certificación en para el comercio intracomunitario.
b) Esta La prueba cutánea de la brucelosis es una de las más específicas para la detección de la presencia de brucelosis en animales no vacunados ; vacunados; no obstante, no se debe realizar el diagnóstico no deberá realizarse únicamente a partir de reacciones intradérmicas positivas.
c) Debe considerarse que están Se considerarán infectados o sospechosos de estarlo los animales de la especie bovina que se hayan sometido a dado un resultado negativo en una de las pruebas serológicas definidas en este el presente anexo con un resultado negativo y que reaccionen positivamente a la prueba cutánea de la brucelosis.
d) Los animales de la especie bovina que se hayan sometido a dado un resultado positivo en una de las pruebas serológicas definidas en este anexo con un resultado positivo pueden podrán someterse a una prueba cutánea de la brucelosis para confirmar corroborar la interpretación de los resultados de las pruebas serológicas, especialmente cuando no pueda excluirse una reacción cruzada con anticuerpos de otras bacterias en el caso de los rebaños indemnes de brucelosis u oficialmente indemnes de brucelosis.
3.1.2 La prueba debe llevarse a cabo se realizará mediante un preparado alergénico alérgeno de la brucelosis normalizado y definido que no contenga el antígeno lipopolisacárido liso antigénico, ya liso, dado que éste este último puede provocar reacciones inflamatorias inespecíficas o interferir con pruebas serológicas posteriores.
Un preparado de tales características es la brucelina INRA, que procede de una cepa no lisa de B. melitensis. Sus Las condiciones de producción aparecen descritas detalladamente de brucelina serán conformes a lo dispuesto en la sección B2 C1 del capítulo 2.4.2 de la cuarta edición de 2000 2.4.3 del Manual de normas para pruebas las Pruebas de diagnóstico Diagnóstico y vacunas de las Vacunas para los Animales Terrestres de la OIE. OIE, sexta edición, de 2008.
3.1.3 Procedimiento de la prueba.
3.1.3.1 Se inyecta inyectará por vía intradérmica un volumen de 0,1 ml de alergeno alérgeno de la brucelosis en el pliegue caudal, en la piel de la ijada o en un lado del cuello.
3.1.3.2 La prueba se lee leerá una vez transcurridas de entre 48 a y 72 horas.
3.1.3.3 Antes de la inyección y en el momento de la lectura, se mide medirá con un pie de rey el grosor de la piel en el lugar de la inyección.
3.1.3.4 Interpretación de los resultados.
Las resultados.–Las reacciones fuertes se reconocen fácilmente por la inflamación y la induración locales.
Se considera considerará que la reacción a la prueba cutánea de la brucelosis es positiva si se produce un aumento del grosor de la piel de entre 1,5 a y 2 mm.
3.2 Prueba de inmunoabsorción enzimática Enzimoinmunoanálisis de competición adsorción competitivo (ELISAc).
3.2.1 Condiciones para el empleo de esta prueba:
a) La uso del ELISAc.–El ELISAc no debe emplearse se utilizará con fines de certificación en para el comercio intracomunitario.
b) La ELISAc ha mostrado tener mayor especificidad que, por ejemplo, Los animales de la ELISA indirecta, y por consiguiente puede usarse especie bovina que hayan dado un resultado positivo en una de las pruebas serológicas definidas en este anexo podrán someterse a un ELISAc para confirmar corroborar la interpretación de los resultados de esa otra prueba serológica, especialmente cuando no pueda excluirse una reacción cruzada con anticuerpos de otras bacterias en el caso de los rebaños indemnes de brucelosis u oficialmente indemnes de brucelosis o para eliminar las pruebas serológicas. reacciones causadas por anticuerpos residuales producidos en respuesta a la vacunación con B19.
3.2.2 Procedimiento de la prueba.
La prueba.–La prueba debe realizarse de acuerdo con el párrafo a) del apartado 2 se efectuará según lo prescrito en la sección B(2) del capítulo 2.3.1 de la cuarta edición de 2000 2.4.3 del Manual de normas para pruebas las Pruebas de diagnóstico Diagnóstico y vacunas de las Vacunas para los Animales Terrestres de la OIE. OIE, sexta edición, de 2008.
4. Laboratorio Nacional nacional de Referencia. referencia.
4.1 El Laboratorio Central de Sanidad Animal (Laboratorio de Sanidad y Producción Animal) de ubicado en Santa Fe (Granada), Camino del Jau s/n, 18320, es el designado como Laboratorio Nacional de Referencia para la brucelosis en animales.
4.2 Tareas y responsabilidades. Las responsabilidades.–Las tareas y responsabilidad del Laboratorio Nacional de Referencia, sin perjuicio de lo dispuesto en los artículos 9, 11 y 14 y en la disposición transitoria cuarta, del presente real decreto, y en el artículo 29 de la Ley 8/2003, de 24 de abril, son las siguientes:
a) Aprobación La aprobación de los resultados de los estudios de validación que demuestren la fiabilidad del método de prueba utilizado en España.
b) Determinación La determinación del número máximo de muestras que deben mezclarse en las baterías de ELISA utilizadas.
c) Calibración La calibración de los sueros patrón nacionales secundarios de referencia ("patrones estándares de trabajo") frente al suero patrón primario internacional mencionado trabajo contemplados en el apartado 2.1. punto 2.1.6.
d) Controles los controles de calidad de todos los lotes de antígenos y de baterías de ELISA utilizados en España.
e) Cooperación dentro de la red La aplicación de laboratorios nacionales las recomendaciones del laboratorio comunitario de referencia para la brucelosis de y la Unión Europea. cooperación con dicho Laboratorio comunitario.
(1) A efectos de este anexo, las diluciones para preparar los reactivos líquidos se expresan, expresan con una fracción, por ejemplo, como ejemplo 1/150, lo que indica una dilución de 1 en 150.