ANEXO 3

ANEXO 3
Diagnóstico de leucosis bovina enzoótica
1. La detección de la leucosis enzoótica bovina se realizará mediante la prueba de inmunodifusión, en las condiciones descritas en las letras A) y B), o mediante la prueba de inmunoabsorción enzimática (ELISA) en las condiciones descritas en la letra C). El método de inmunodifusión sólo se aplicará en las pruebas individuales.
A) Prueba de inmunodifusión en gel de agar
1. El antígeno que habrá de utilizarse en esta prueba deberá contener glicoproteínas del virus de la leucosis bovina. El antígeno deberá estar contrastado en relación con un suero patrón (suero E1) suministrado por el Statens Veterinaere Serum Laboratorium de Copenhague.
2. Los antígenos patrón utilizados en el laboratorio deberán ser presentados, por lo menos una vez al año, en el laboratorio de referencia, para someterlos a prueba en relación con el suero patrón CEE. Independientemente de esta valoración, el antígeno utilizado podrá ser controlado con arreglo a lo dispuesto en la letra B).
3. La prueba aplicará los reactivos siguientes:
a) Antígeno: El antígeno deberá contener glicoproteínas específicas del virus de la leucosis enzoótica bovina que haya sido contrastado respecto al suero oficial CEE.
b) El suero para prueba.
c) Un suero de control positivo conocido.
d) Gel de agar: 0,8 por 100 de agar, 8,5 por 100 de NaCl, Tampón Tris 0,05 M, pH 7,2.
Deberán introducirse 15 mililitros de gel de agar en una placa de Petri de 85 milímetros de diámetro, lo que dará una profundidad de 2,6 milímetros de gel.
4. Se deberá hacer una red experimental de siete pocillos exentos de humedad mediante perforación del agar hasta el fondo de la placa; dicha red consistirá en un pocillo central alrededor del cual se ordenarán seis pocillos periféricos dispuestos en círculo.
Diámetro del pocillo central: 4 milímetros.
Diámetro de los pocillos periféricos: 6 milímetros.
Distancia entre el pocillo central y los periféricos: 3 milímetros.
5. Se deberá llenar de antígeno patrón el pocillo central. Los pocillos periféricos 1 y 4 (ver esquema anterior) se llenarán con el suero positivo conocido y los pocillos 2, 3, 5 y 6 con los (aquí croquis) sueros de prueba. Los pocillos deberán llenarse hasta la desaparición del menisco.
6. Las cantidades añadidas serán las siguientes: Antígeno: 32 microlitros, Suero de control: 73 microlitros, Suero de prueba: 73 microlitros.
7. La incubación deberá durar setenta y dos horas a temperatura ambiente (20-27 ºC) en un recinto húmedo cerrado.
8. La prueba podrá leerse veinticuatro y cuarenta y ocho horas después, pero no se podrá obtener ningún resultado final antes de transcurridas setenta y dos horas:
a) Un suero de prueba será positivo si forma una curva de precipitación específica con el antígeno del virus de la leucosis bovina y si dicha curva coincide con la del suero de control.
b) Un suero de prueba será negativo si no da una curva de precipitación específica con el antígeno del virus de la leucosis bovina y si no desvía la curva del suero de control.
c) La reacción no podrá considerarse concluyente si:
1.º El suero desvía la curva del suero de control hacia el pocillo del antígeno del virus de la leucosis bovina sin formar una curva de precipitación visible con el antígeno.
2.º No es posible interpretarla como negativa ni como positiva.
En caso de reacciones dudosas, podrá repetirse la prueba y utilizar suero concentrado.
9. Podrá utilizarse cualquier otra configuración o red de oquedades siempre que el suero E4, en una dilución a 1:10 en suero negativo, pueda ser detectado como positivo.
B) Método de valoración del antígeno
a) Soluciones y materiales necesarios:
1. 40 mililitros de gel de agar de 1,6 por 100 en un tampón Tris 0,05 M/HCL de pH 7,2, con 8,5 por 100 de NaCl.
2. 15 mililitros de un suero de la leucosis bovina que sólo contenga anticuerpos respecto a las glicoproteínas del virus de la leucosis bovina, diluido al 1:10 en un tampón Tris 0,05 M/HCl de pH 7,2 con 8,5 por 100 de NaCl.
3. 15 mililitros de un suero de la leucosis bovina que sólo contenga anticuerpos respecto a las glicoproteínas del virus de la leucosis bovina, diluido a 1:5 en un tampón Tris 0,05 M/HCl de pH 7,2 con 8,5 por 100 de NaCl.
4. Cuatro placas de Petri de plástico de un diámetro de 85 milimetros.
5. Un punzón de un diámetro de 4 a 6 milimetros.
6. Un antígeno de referencia.
7. El antígeno que haya de valorarse.
8. Un baño de agua (56 ºC).
b) Procedimiento:
Disolver el gel (1,6 por 100) en el tampón Tris/HCl calentando con precaución hasta 100ºC. Colocar en el baño de agua a 56ºC durante una hora aproximadamente. Colocar además las soluciones del suero de la leucosis bovina previstas en el baño de agua a 56ºC.
Mezclar a continuación 15 ml de la solución de gel a 56 .ºC con los 15 mililitros de suero Decisión 2009/976/UE, de la leucosis bovina (1:10), agitar rápidamente y verter en dos placas de Petri, a razón Comisión, de 15 mililitros por placa.
Repetir el procedimiento con suero de la leucosis bovina diluido a 1:15.
Cuando el gel de agar haya endurecido, se practicarán los agujeros de la forma siguiente:
c) Adicción de antígenos:
I. Placas de Petri números 1 y 3:
A: Antígeno de referencia, no diluido.
B: Antígeno de referencia, diluido al 1/2.
C: +E: Antígenos de referencia.
D: Antígeno a testar, no diluido.
II. Placas de Petri números 2 y 4:
A: Antígeno a testar, no diluido.
B: Antígeno a testar, diluido al 1/2.
C: Antígeno a testar, diluido al 1/4.
D: Antígeno a testar, diluido al 1/8.
d) Instrucciones complementarias:
1. El experimento deberá realizarse con dos grados de dilución del suero (1:5 y 1:10), a fin de obtener la precipitación óptima.
2. Si el diámetro de precipitación fuere excesivamente débil con los dos grados de dilución, el suero deberá ser objeto de una dilución suplementaria.
3. Si el diámetro de precipitación fuere excesivo para los dos grados de dilución y si el precipitado desapareciese, se deberá escoger un grado más débil de dilución para el suero.
4. La concentración final del gel deberá establecerse en 0,8 por 100, y la diciembre de los sueros en 5 por 100 y en 10 2009, por 100, respectivamente.
5. Anotar los diámetros medidos en el sistema coordinado siguiente. La dilución de trabajo será aquella en la que se registre el mismo diámetro para el antígeno de prueba que para modifica el antígeno de referencia.
C) Prueba de inmunoabsorción enzimática (ELISA) para la detección anexo D de la leucosis enzoótica bovina
1. Los materiales que habrán de utilizarse Directiva 64/432/CEE del Consejo en el método ELISA son los siguientes:
a) Microplacas de fase sólida, platillos o cualquier otra fase sólida.
b) El antígeno se fijará a la fase sólida con o sin ayuda de anticuerpos captores policlonales o monoclonales. Si el antígeno se asocia directamente lo relativo a la fase sólida, todas las muestras de ensayo que den reacciones positivas deberán someterse a nuevas pruebas con el antígeno de control en el caso diagnóstico de la leucosis enzoótica bovina. El antígeno de control deberá ser idéntico al antígeno examinado, excepto en el caso de los antígenos VLB (virus de la leucosis bovina). Si los anticuerpos captores están asociados a la fase sólida, los anticuerpos sólo deben reaccionar ante antígenos VLB.
c) El líquido biológico que se vaya a examinar.
d) Un control positivo y otro negativo.
e) Un conjugado.
f) Un substrato adaptado a los enzimas utilizados.
g) En caso necesario, una solución de interrupción.
h) Soluciones para la dilución de las muestras de ensayo, para las preparaciones de reactivos y para el lavado.
i) Un sistema de lectura que corresponda al substrato utilizado.
2. Normalización y sensibilidad de la prueba.
La sensibilidad de la prueba ELISA deberá ser de un nivel tal que el suero E4 dé positivo tras diluirse 10 veces (muestras de suero) o 250 veces (muestras de leche) más que la dilución obtenida a partir de muestras individuales puestas en común. En ensayos en los que las muestras (suero y leche) sean sometidas a pruebas por separado, el suero E4 diluido en una proporción de 1 a 10 (suero negativo) o 1:250 (leche negativa) deberá dar positivo cuando se someta a la prueba en la misma dilución de ensayo utilizada para las pruebas individuales. El Laboratorio Nacional de Referencia será responsable del control de la calidad del método ELISA y, en particular, de determinar, en función del título obtenido con el suero E4, el número de muestras que pueden mezclarse en cada lote de producto.
El laboratorio veterinario nacional de Copenhague suministrará el suero E4.
3. Condiciones de utilización de la prueba ELISA para la detección de la leucosis enzoótica bovina.
El método ELISA podrá aplicarse a una muestra de leche o lactosuero tomada de la leche procedente de una explotación donde al menos un 30 por 100 de las vacas estén en período de lactación.
Cuando se utilice este método, deberán adaptarse medidas que garanticen la relación entre las muestras tomadas, los animales de los que procedan la leche o los sueros que se examinan.
D) Laboratorio Nacional de Referencia
El Laboratorio Central de Sanidad y Producción Animal de ubicado en Algete (Madrid), perteneciente al del Ministerio de Agricultura, Pesca Medio Ambiente, y Alimentación, Medio Rural y Marino, es el designado como Centro Laboratorio Nacional de Referencia para la leucosis enzoótica bovina.